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    電子束輻照對(duì)鱸魚肉肌原纖維蛋白生化特性及其構(gòu)象的影響

    2019-07-20 03:26:50宣仕芬徐大倫張進(jìn)杰錢云霞楊文鴿
    食品科學(xué) 2019年13期
    關(guān)鍵詞:鹽溶二硫鍵肌原纖維

    張 晗,高 星,宣仕芬,徐大倫,張進(jìn)杰,錢云霞,楊文鴿*

    (寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315211 )

    鱸魚(Lateolabrax japonicus)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類之一,2016年全國(guó)海水鱸魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)12.25萬(wàn) t[1],鱸魚肉因其高蛋白低脂肪及鮮美的滋味而備受人們喜愛(ài),然而新鮮鱸魚肉容易腐敗,因此,延長(zhǎng)其貨架期十分必要。電子束輻照作為新型的冷殺菌方式,常用于農(nóng)畜產(chǎn)品及水產(chǎn)品的殺菌保鮮。楊文鴿等[2]采用電子束輻照處理鮮牡蠣,發(fā)現(xiàn)1~5 kGy輻照抑菌效果明顯,可延長(zhǎng)貨架期4~8 d;Alahakoon等[3]研究電子束輻照結(jié)合柑橘提取物對(duì)雞胸肉的影響,結(jié)果表明輻照后雞胸肉的菌落總數(shù)明顯減少。近年來(lái)電子束輻照在鱸魚保鮮方面的應(yīng)用亦逐漸開(kāi)展,如鉏曉艷等[4]發(fā)現(xiàn)鱸魚肉經(jīng)低于4.41 kGy的電子束輻照,能最大限度保持其感官品質(zhì)和質(zhì)構(gòu)特性;本實(shí)驗(yàn)室亦采用電子束輻照處理鱸魚肉,發(fā)現(xiàn)冷藏前經(jīng)3~5 kGy輻照,能降低1~2 個(gè)數(shù)量級(jí)的菌落總數(shù),延長(zhǎng)鱸魚肉貨架期6~10 d[5]。

    然而,輻照在殺滅微生物、延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的同時(shí),也能作用于蛋白等生物大分子而引起肌肉蛋白質(zhì)化學(xué)作用力、生化特性的改變,導(dǎo)致蛋白變性或凝膠化。Shi Yan等[6]采用γ射線輻照處理魚肉,發(fā)現(xiàn)隨著輻照劑量的增加,肌球蛋白重鏈含量逐漸減少,當(dāng)輻照劑量達(dá)到8 kGy時(shí),肌球蛋白重鏈徹底消失,并推測(cè)與輻照引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)有關(guān);陳茜茜等[7]發(fā)現(xiàn)輻照后牛肉蛋白的羰基含量明顯增加,認(rèn)為輻照促進(jìn)了蛋白質(zhì)的氧化;Cie?la等[8]研究表明輻照后牛奶蛋白在酰胺I帶的吸收峰有明顯的紅移現(xiàn)象。肌原纖維蛋白作為魚肉蛋白重要的組成部分,其生化特性及其結(jié)構(gòu)的變化與蛋白的功能特性、魚肉品質(zhì)密切相關(guān)。因此,采用輻照保鮮魚肉的同時(shí),關(guān)注輻照劑量對(duì)肌原纖維蛋白生化特性及其結(jié)構(gòu)的影響亦十分重要。本實(shí)驗(yàn)以新鮮海鱸魚(Lateolabrax japonicus)肉為原料,通過(guò)不同劑量電子束輻照處理,分析輻照對(duì)魚肉肌原纖維蛋白鹽溶蛋白含量、巰基含量、二硫鍵含量、Ca2+-ATPase活力、表面疏水性以及蛋白羰基含量的影響,并結(jié)合圓二色光譜分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),在分子水平探討輻照對(duì)肌原纖維蛋白生化特性的影響機(jī)理,為輻照技術(shù)在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮮活海鱸魚(Lateolabrax japonicu)購(gòu)于寧波路林水產(chǎn)市場(chǎng),共50 條,每條體質(zhì)量約500 g,體長(zhǎng)約35 cm?;铘~宰殺后去除頭、尾、內(nèi)臟,清洗干凈后沿脊柱分為兩半。鱸魚肉每包300 g,真空包裝備用。

    Tris-馬來(lái)酸、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic a c i d,E D TA)、5,5’-二硫代2-硝基苯甲酸(5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DNTB) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2,4-二硝基苯肼、鹽酸胍 上海阿拉丁試劑公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Biofuge Stratos型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo Scientific Sorval公司;BP221S電子分析天平德國(guó)Sartorius公司;SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;J-1500型圓二色光譜儀 Jasco日本分光株式會(huì)社;NBL-1010型電子直線加速器寧波超能科技股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 魚肉的電子束輻照處理

    采用NBL-1010型電子直線加速器(能量10 MeV、劑量率1 kGy/s)對(duì)鱸魚肉進(jìn)行輻照處理,劑量分別為0、1、3、5、7 kGy,其中0 kGy為對(duì)照組。為保證輻照均勻性,魚肉單包排列。各劑量設(shè)置3 組平行,輻照后立即取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

    1.3.2 肌原纖維蛋白的提取與含量測(cè)定

    參考林嫻萍等[9]的方法稍作修改。取2 g鱸魚肉,加入10 倍體積緩沖液A(20 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來(lái)酸、0.05 mol/L KCl),勻漿,10 000 r/min離心15 min,沉淀用緩沖液A洗滌2 次。沉淀加入15 倍體積緩沖液B(20 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來(lái)酸、0.6 mol/L KCl),勻漿后浸提60 min,10 000 r/min離心15 min,上清液即為肌原纖維蛋白溶液,采用雙縮脲法測(cè)定蛋白含量。

    1.3.3 總巰基和活性巰基含量的測(cè)定

    根據(jù)Benjakul等[10]的方法稍作修改。取1 mL肌原纖維蛋白溶液,加9 mL Tris-HCl(含8 mol/L尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%十二烷基硫酸鈉、10 mol/L EDTA,pH 6.8),混勻后取4 mL加0.4 mL 0.1% DNTB溶液(DNTB溶于0.2 mol/L Tris-HCl,pH 8.0),40 ℃水浴25 min,于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。用0.6 mol/L KCl替代樣品,作為空白?;钚詭€基含量測(cè)定時(shí),采用不含尿素的Tris-HCl,其余操作均同上。以摩爾吸光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)計(jì)算巰基含量。

    1.3.4 二硫鍵含量的測(cè)定

    根據(jù)Thannhauser等[11]的方法測(cè)定二硫鍵含量。

    1.3.5 表面疏水性的測(cè)定

    現(xiàn)代企業(yè)制度的建立是基于設(shè)備管理基礎(chǔ)上的,設(shè)備全過(guò)程的管理包括了人員組織、技術(shù)應(yīng)用以及經(jīng)濟(jì)總體功能等內(nèi)容,實(shí)現(xiàn)了無(wú)形價(jià)值理念與具體設(shè)備實(shí)物管理的結(jié)合,讓企業(yè)對(duì)設(shè)備的高效實(shí)用與管理奠定了基礎(chǔ)。

    根據(jù)Chelh等[12]的方法稍作修改,以溴酚藍(lán)結(jié)合量表征肌原纖維蛋白的表面疏水性,兩者呈正相關(guān)。用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH 6.0)將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL。取1 mL肌原纖維蛋白溶液,加入1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液200 μL,混合均勻,25 ℃下反應(yīng)10 min,3 000 r/min離心15 min,將上清液稀釋10 倍,于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以磷酸鹽緩沖液作為空白。溴酚藍(lán)結(jié)合量按下式計(jì)算。

    式中:A0為空白吸光度;A為樣品吸光度。

    1.3.6 Ca2+-ATPase活力的測(cè)定

    采用Thanonkaew等[13]的方法測(cè)定,結(jié)果以每分鐘生成1 μmol磷所需的酶量為一個(gè)活力單位,單位為μmol/(mg·min)。

    1.3.7 蛋白羰基含量的測(cè)定

    參照Oliver等[14]的方法,并稍作修改。取1 mL肌原纖維蛋白溶液,加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼,室溫下在暗處?kù)o置1 h,加入1 mL體積分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸,10 000 r/min離心10 min,沉淀用1 mL乙酸乙酯-乙醇(1∶1,V/V)清洗3 次,加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液,37 ℃水浴15 min,10 000 r/min離心5 min,于370 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以摩爾吸光系數(shù)2 200 L/(mol·cm)計(jì)算蛋白羰基含量。

    1.3.8 圓二色光譜測(cè)定

    參照楊玉玲等[15]的方法略作修改。提取的肌原纖維蛋白用緩沖液B稀釋至0.2 mg/mL進(jìn)行圓二色光譜檢測(cè)。掃描光譜范圍190~240 nm,比色皿直徑1 mm,測(cè)定溫度25 ℃,掃描速率50 nm/min,響應(yīng)時(shí)間0.25 s,光譜重復(fù)掃描3 次,累加得到圓二色光譜圖。以緩沖液B為空白,利用儀器自帶軟件分析肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的含量。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,分別采用SAS 9.1.3和Origin 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。其中P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 電子束輻照劑量對(duì)鱸魚肉肌原纖維蛋白鹽溶性的影響

    圖1 輻照劑量對(duì)魚肉鹽溶蛋白含量的影響Fig. 1 Effect of irradiation dose on salt-soluble protein content of fi sh meat

    蛋白溶解性常用于表示蛋白質(zhì)交聯(lián)和聚集的程度,在一定程度上可表征蛋白的氧化程度。由圖1可知,當(dāng)輻照劑量為3 kGy及以下時(shí),肌原纖維蛋白鹽溶性無(wú)顯著變化(P>0.05),當(dāng)輻照劑量繼續(xù)上升時(shí),鹽溶蛋白含量顯著下降(P<0.05)。魚肉蛋白的功能特性主要取決于肌原纖維蛋白,蛋白質(zhì)的變性會(huì)使其溶解性下降,從而使鹽溶蛋白含量減少[16]。高劑量輻照使鹽溶蛋白含量減少,原因可能是由于輻照能使肌原纖維蛋白發(fā)生氧化變性[17-18],且輻照劑量越高,這種氧化現(xiàn)象越明顯,導(dǎo)致蛋白鹽溶性顯著降低。

    2.2 電子束輻照劑量對(duì)鱸魚肉肌原纖維蛋白巰基及二硫鍵含量的影響

    由圖2可知,隨著輻照劑量的增加,總巰基含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,1 kGy與3 kGy輻照組肌原纖維蛋白的總巰基含量顯著增加,活性巰基含量無(wú)顯著差異(P>0.05),而當(dāng)輻照劑量為5 kGy和7 kGy時(shí),總巰基和活性巰基含量均開(kāi)始下降,并且顯著低于1、3 kGy輻照組和對(duì)照組(P<0.05)。相較于對(duì)照組,1 kGy輻照后肌原纖維蛋白中二硫鍵含量略有上升,但并不明顯(P>0.05),隨著輻照劑量的增加,二硫鍵含量亦呈現(xiàn)繼續(xù)上升的趨勢(shì)。兩個(gè)巰基被氧化形成的共價(jià)鍵即為二硫鍵,從圖2可以看出,巰基含量的下降伴隨著二硫鍵含量的上升,說(shuō)明一定劑量的輻照會(huì)加速蛋白質(zhì)氧化變性。輻照能暴露部分包埋于蛋白分子內(nèi)部的巰基,低劑量組巰基含量的上升可能是由于分子內(nèi)部巰基的暴露,然而電子束輻照又會(huì)促進(jìn)魚肉中的水等小分子物質(zhì)發(fā)生電離,產(chǎn)生羥自由基等促進(jìn)巰基的氧化,高劑量組巰基含量的顯著下降伴隨著二硫鍵含量的顯著上升,這與羥基自由基的產(chǎn)生、暴露出的巰基更容易被氧化有關(guān)[19-21]。Jaczynski等[22]研究輻照對(duì)狹鱈魚魚糜凝膠肌原纖維蛋白巰基含量的影響,結(jié)果表明總巰基和活性巰基含量在0~6 kGy均隨輻照劑量的增大而增加,當(dāng)輻照劑量大于6 kGy時(shí)逐漸減小,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似;王寧等[23]在研究輻照對(duì)牛肉蛋白影響時(shí)亦得到類似結(jié)果。結(jié)合圖1、2,鹽溶蛋白和巰基含量的下降均出現(xiàn)在輻照劑量大于3 kGy,認(rèn)為肌原纖維蛋白鹽溶性的下降與其巰基被氧化密切相關(guān)。

    圖2 輻照劑量對(duì)肌原纖維蛋白巰基及二硫鍵含量的影響Fig. 2 Effect of irradiation dose on sulfhydryl and disulfide bond content of myofibrillar protein

    2.3 電子束輻照劑量對(duì)鱸魚肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的影響

    圖3 輻照劑量對(duì)肌原纖維蛋白Ca2-ATPase活力的影響Fig. 3 Effect of irradiation dose on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein

    Ca2+-ATPase活力是評(píng)價(jià)肌動(dòng)球蛋白完整性的良好指標(biāo),蛋白質(zhì)的變性會(huì)引起其酶活力的改變。如圖3所示,1 kGy輻照組肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力為0.0 2 6 2 μ m o l/( m g· m i n) , 與 對(duì) 照 組0.026 1 μmol/(mg·min)無(wú)顯著差異(P>0.05)。當(dāng)輻照劑量上升至3 kGy時(shí),Ca2+-ATPase活力顯著下降至0.022 9 μmol/(mg·min)(P<0.05)。隨著輻照劑量的繼續(xù)上升,Ca2+-ATPase活力繼續(xù)下降,7 kGy輻照組僅為0.021 0 μmol/(mg·min)。Ca2+-ATPase的活性中心位于肌球蛋白頭部[24],Ca2+-ATPase活力的下降可能是輻照使肌球蛋白的球狀頭部構(gòu)型發(fā)生改變引起的。此外,有學(xué)者認(rèn)為,由于巰基氧化產(chǎn)生二硫鍵使分子聚合,也會(huì)導(dǎo)致ATPase活力的下降。本研究中,Ca2+-ATPase活力的下降與Li Yanqing等[25]的發(fā)現(xiàn)相似,高劑量的輻照破壞了肌動(dòng)球蛋白的完整性,使肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力發(fā)生不同程度的下降。

    2.4 電子束輻照劑量對(duì)鱸魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

    圖4 輻照劑量對(duì)肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 4 Effect of irradiation dose on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

    當(dāng)?shù)鞍讟?gòu)象發(fā)生變化,包埋于分子內(nèi)部的一些疏水性氨基酸殘基會(huì)暴露于分子表面,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生變化。如圖4所示,電子束輻照后,鱸魚肉肌原纖維蛋白的表面疏水性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),并于5 kGy時(shí)達(dá)到最大值。表面疏水性的上升是由于肌原纖維蛋白受到輻照后發(fā)生氧化,一些疏水性氨基酸殘基暴露于蛋白分子表面。此外,輻照所產(chǎn)生的自由基通過(guò)攻擊氨基酸側(cè)鏈而影響肌原纖維蛋白的表面疏水性,當(dāng)輻照劑量高至7 kGy時(shí),表面疏水性顯著下降(P<0.05),原因在于高劑量的輻照使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),暴露在表面的疏水基團(tuán)又被重新包埋,引起表面疏水性下降[26]。An等[27]采用輻照處理過(guò)氧化物酶蛋白,其表面疏水性也呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì),且在5 kGy時(shí)達(dá)到最大值。

    2.5 電子束輻照劑量對(duì)鱸魚肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響

    圖5 輻照劑量對(duì)肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 5 Effect of irradiation dose on carbonyl content of myofibrillar protein

    羰基含量是衡量肌肉蛋白氧化的重要指標(biāo)之一,羰基的形成途徑有兩種:通過(guò)多肽主鏈的斷裂[28]和氨基酸側(cè)鏈的直接氧化[29],或通過(guò)美拉德反應(yīng)以及非蛋白羰基化合物的共價(jià)結(jié)合[30]形成。輻照后,鱸魚肉肌原纖維蛋白羰基含量的變化如圖5所示。與對(duì)照組相比,除1 kGy輻照組羰基含量無(wú)顯著性變化外(P>0.05),3、5、7 kGy輻照樣品肌原纖維蛋白羰基含量均顯著上升(P<0.05),這一結(jié)果與電子束輻照對(duì)鱸魚肉脂質(zhì)氧化指標(biāo)硫代巴比妥酸值的影響[5]一致。通過(guò)輻照產(chǎn)生的自由基攻擊蛋白肽鏈,使氨基酸側(cè)鏈—NH或—NH2發(fā)生修飾而轉(zhuǎn)化為羰基,且輻照劑量越高,輻解產(chǎn)生的自由基也越多[31],肌原纖維蛋白更易受到攻擊而發(fā)生氧化。Riebroy等[32]采用0、2、6 kGy γ輻照處理鯛魚蛋白也得到了類似的結(jié)果,輻照鯛魚蛋白羰基含量明顯高于對(duì)照組,且劑量越大,羰基含量越高。

    2.6 電子束輻照劑量對(duì)鱸魚肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

    圖6 肌原纖維蛋白的圓二色光譜圖Fig. 6 CD spectrum of myofibrillar protein

    圖7 輻照劑量對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig. 7 Effect of irradiation dose on secondary structure contents of myofibrillar protein

    圓二色光譜借助于光學(xué)活性物質(zhì)在左右旋偏振光照射下表現(xiàn)出的偏振光之差分析分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息,是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要工具。蛋白質(zhì)的圓二色性主要來(lái)源于酰胺鍵的相互作用,因此常于190~250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)量其圓二色光譜[33-34]。圖6為輻照前后鱸魚肉肌原纖維蛋白圓二色光譜圖,經(jīng)分析得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量如圖7所示。在天然狀態(tài)下,蛋白質(zhì)以特定形狀的折疊態(tài)類球狀分子存在,當(dāng)發(fā)生變性時(shí),其折疊狀態(tài)會(huì)逐漸打開(kāi)。輻照所產(chǎn)生的自由基可能會(huì)對(duì)蛋白肽鏈以及氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行攻擊,從而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。從圖7可以看出,輻照后鱸魚肉肌原纖維蛋白中α-螺旋含量的下降伴隨著β-折疊含量的增加,而β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲含量無(wú)顯著變化(P>0.05)。與對(duì)照組相比,1 kGy輻照組肌原纖維蛋白的α-螺旋和β-折疊含量?jī)H有微小變化,表明1 kGy輻照對(duì)肌原纖維蛋白構(gòu)象無(wú)明顯的改變,這與1 kGy輻照組肌原纖維蛋白除總巰基含量外其他生化指標(biāo)均無(wú)顯著變化相一致。隨著輻照劑量繼續(xù)上升,肌原纖維蛋白的α-螺旋含量下降,β-折疊含量增加,說(shuō)明高劑量輻照會(huì)促進(jìn)肌原纖維蛋白中的α-螺旋向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,相比于緊密的α-螺旋構(gòu)象,β-折疊結(jié)構(gòu)的肽鏈在空間的排列更加伸展,使位于分子內(nèi)部的—SH等活性基團(tuán)和疏水基團(tuán)暴露出來(lái),蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性,從而影響了肌原纖維蛋白的生化特性,且高劑量的輻照對(duì)蛋白特性的影響更大。肌原纖維蛋白生化特性的改變對(duì)魚肉的質(zhì)構(gòu)特性會(huì)帶來(lái)一定影響,隨著輻照劑量的增加,魚肉的硬度略微上升,彈性、咀嚼性和回復(fù)性則有所下降,其中咀嚼性在輻照劑量達(dá)到3 kGy及以上時(shí)顯著下降[5]。

    3 結(jié) 論

    電子束輻照對(duì)鱸魚肉進(jìn)行保鮮的同時(shí),亦會(huì)引起魚肉肌原纖維蛋白的氧化變性。電子束輻照后,鱸魚肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,隨著輻照劑量的上升,

    α-螺旋含量減少,β-折疊含量逐漸增加,肌原纖維蛋白肽鏈在空間的排列更加舒展,暴露了部分包埋在分子內(nèi)部的活性基團(tuán)和疏水基團(tuán),從而影響了肌原纖維蛋白的生化特性。與對(duì)照組相比,1 kGy輻照組鱸魚肉肌原纖維蛋白除總巰基含量外各指標(biāo)無(wú)顯著性變化,3 kGy輻照組肌原纖維蛋白鹽溶性和巰基含量與1 kGy組無(wú)顯著差異,而5 kGy和7 kGy輻照組魚肉蛋白鹽溶性、巰基含量、二硫鍵含量、表面疏水性、蛋白羰基含量以及Ca2+-ATPase活力均發(fā)生顯著變化。輻解產(chǎn)生的自由基能加速肌原纖維蛋白的氧化變性,而這些變化都將影響肌原纖維蛋白的功能及鱸魚肉的品質(zhì)。因此,利用電子束輻照保鮮魚肉,應(yīng)結(jié)合保鮮效果選擇較低劑量進(jìn)行輻照處理。

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