基于網(wǎng)絡藥理學挖掘玉米須干預糖尿病的機制研究

高 瑩 ，張晶璇 ，黃 羚

（1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

玉米須是禾本科植物玉蜀黍（Zea mays L.）的花柱和柱頭，味甘、淡，性平，歸膀胱、肝、膽經(jīng)，具有利尿消腫，清肝利膽的功效[1]。明代醫(yī)藥家蘭茂最先記載其于《滇南本草》，2010版《中華人民共和國藥典》將其收入為利尿中藥，《浙江民間草藥》等地方藥志記載其有治療水腫，糖尿病等作用。因其價格低廉、無不良反應[2]，亦食亦藥，受到越來越多的關注。目前，玉米須在糖代謝疾病中的應用報道日漸增多[3]，多數(shù)研究多停留在藥效學研究層面，對于其干預糖尿病的活性成分的研究仍是一片空白，且其作用機制的研究尚未深入，不利于玉米須的進一步開發(fā)利用。

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病病因復雜多樣，包括遺傳因素、環(huán)境因素等，是最常見的“生活方式疾病”。全球約有4.25億糖尿病患者[4]，他們當中許多人面臨著病情進展帶來的腎臟、心臟、血管、眼部、神經(jīng)等損害，胰島素是目前治療糖尿病的最有效方法，但胰島素療法無法逆轉疾病的發(fā)展過程，更無法徹底治愈，同時存在不良反應大等弊端，因此，從中醫(yī)藥寶庫中挖掘干預糖尿病的有效方劑從而達到中西醫(yī)結合使用減少西藥副作用，提高糖尿病臨床療效變得尤有意義。本研究借助網(wǎng)絡藥理學的方法挖掘玉米須的主要活性，探討活性成分的作用靶標與糖尿病的關聯(lián)性，探討玉米須對糖尿病的多成分-多靶標-疾病的干預作用機制，為其開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 玉米須的活性成分和靶標 運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP），以“玉米須”為關鍵詞檢索其活性成分及靶標。以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為標準篩選出活性成分，提取玉米須各活性成分的靶標，形成中藥-靶標網(wǎng)絡。

1.2 疾病-靶標網(wǎng)絡構建 運用人類表型術語集（HPO）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（CTD）和 TCMSP，以“diabetes mellitus”為關鍵詞檢索其靶標，用于完成疾病及靶標間關系網(wǎng)絡的構建工作。并通過全球蛋白質資源數(shù)據(jù)庫（UniProt）翻譯成相應基因。

1.3 各靶標間相互作用關系的構建 將交集后中藥-疾病靶標在相互作用基因/蛋白質的檢索工具網(wǎng)站（STRING）中，選擇“multiple proteins”后，輸入相關靶標名稱，在“organism”中選擇“homo sapiens”進行檢索，得到相應蛋白關系圖，選擇“molecular action”進行分析，記錄蛋白間相互作用類型及得分。

1.4 GO功能富集和KEGG信號通路分析 在STRING平臺進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）的信號通路富集分析和基因本體（GO）的生物過程富集分析，以P＜0.05進行靶基因篩選，分析玉米須發(fā)揮藥理作用的主要信號通路及生物過程。

2 結果

2.1 玉米須主要活性成分 篩選出玉米須主要活性成分12種，使用化學文摘社（CAS）以及化學信息搜索（Pubmed Chemicalbook，Pubchem）進行結構和化合物類型確認，共有主要為黃酮類、甾體衍生物、玉米黃素和脂肪酸類。見表1。

表1 玉米須主要活性成分Tab.1 Main active components of Maydis Seigma

2.2 各靶標間的相互作用 通過檢索，得到玉米須的靶標基因為92個，糖尿病的靶標基因為102個，經(jīng)交集顯示，藥物-疾病交集靶標基因為8個。玉米須的潛在靶標與糖尿病疾病靶標之間的蛋白質-蛋白質相互作用信息（PPI）通過STRING獲得。網(wǎng)絡中包含8個節(jié)點，平均度值為1.75。見圖1。其中，有7項相關靶標的相互作用，見表2。

圖1 基于STRING的藥物—疾病靶標相互作用圖Fig.1 Drug-disease target interaction map based on STRING

表2 玉米須干預糖尿病的相關靶標相互作用（關系系數(shù)≥0.455）Tab.2 PPI of Maydis Seigma intervention in diabetes mellitus（correlation coefficient≥ 0.455）

2.3 玉米須干預糖尿病的GO功能富集 對交集靶標基因進行GO生物過程富集，篩選到P＜0.05的GO條目87個，按照P值由小到大排列的前20條主要生物過程見表3。結果顯示，其GO基因生物功能主要涉及：血糖穩(wěn)態(tài)；對體內外多種有機物、無機物的反應例如細胞對有機氮化合物的反應、細胞對有機環(huán)化合物的反應、對氧的反應、對脂肪酸的反應、肽類激素刺激的細胞反應、細胞對含氧化合物的反應；脂肪代謝相關生物過程包括棕色脂肪細胞分化、脂肪細胞分化的正調控、脂肪酸代謝過程的調節(jié)、脂代謝過程的正調節(jié)、前體代謝物和能量生成調控；一氧化氮生物合成過程的正調控；細胞增殖的正調控、細胞增殖調控；飲食誘導發(fā)熱；運輸?shù)恼{控；生殖發(fā)育過程、生殖結構發(fā)育。

2.4 玉米須干預糖尿病的KEGG信號通路分析 篩選出P＜0.05的信號通路共37條，按照P值由小到大排列的前20條主要KEGG信號通路見圖2。糖尿病相關通路2條：胰島素信號通路、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）信號通路；循環(huán)系統(tǒng)相關信號通路4條：腎上腺素在心肌細胞信號轉導、擴張型心肌病、VEGF信號通路、cGMP-PKG信號通路；癌癥相關通路3條：癌癥的途徑、小細胞肺癌、Ras信號通路、HIF-1信號通路；內分泌相關信號通路3條：卵巢類固醇激素分泌、雌激素信號轉導通路、孕酮介導的卵母細胞成熟；炎癥相關信號通路1條：TNF信號通路；神經(jīng)遞質通路1條：膽堿能突觸。另有通訊連接、細胞凋亡、唾液分泌、蛋白質的消化和吸收等通路可能是玉米須干預糖尿病的途徑。

圖2 玉米須干預糖尿病的KEGG主要相關通路注釋圖Fig.2 Chart of KEGG major related pathways of Maydis Seigma intervention in diabetes mellitus

其中，結果顯示RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、胰島素受體（INSR）和 cAMP 依賴性蛋白激酶催化亞單位α（PRKACA）參與了胰島素信號通路。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）和AKT1、INSR參與了AMPK信號通路。見圖3。

3 討論

圖3 胰島素信號通路參與2型糖尿病的過程Fig.3 Insulin signaling pathway involved in the process of type 2 diabetes mellitus

玉米須有“食物中的降糖藥”之稱，在2015年之前一直被作為利尿類中藥寫入《中華人民共和國藥典》，其利尿消腫，清肝利膽的功效明確，臨床運用廣泛[5-7]。本研究篩選出玉米須最主要的活性成分為黃酮類、甾體衍生物、玉米黃素和脂肪酸類。文獻支持黃酮類為玉米須降血糖的主要活性成分，也是被研究最多、運用范圍最廣的玉米須成分[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9]，黃酮類成分除了有降血糖的作用以外，還有抗氧化作用、清除自由基、抗病毒等藥理作用。研究者認為[10]玉米須的抗氧化作用能夠減輕四氧嘧啶對胰島β-細胞損傷程度，從而提高胰島的分泌功能達到降血糖作用。這與本研究GO富集預測得出的玉米須可能通過對氧的反應、細胞對含氧化合物的反應等生物過程干預糖尿病密切相關。玉米黃素也具有很強的抗氧化性，同時又是構成視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的主要色素成分，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的黃斑變性治療上可作為保護因素[11]。

本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法篩選出玉米須主要活性成分12種及靶標92個，涉及糖尿病的靶標有8個。KEGG分析顯示靶基因主要分布于糖尿病、循環(huán)系統(tǒng)、癌癥、炎癥等4大類14條通路，以及其他與轉錄調控、物質代謝和細胞存活相關的通路。本研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病相關通路主要是胰島素信號通路、AMPK信號通路，胰島素信號通路是一條很重要的2型糖尿病通路，根據(jù)KEGG胰島素信號通路參與2型糖尿病的過程。

AMPK是糖代謝的主要調控分子，在細胞能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)中起到關鍵作用。張利軍等人的研究表明[12]，黃酮類能夠通過激活AMPK通路使糖代謝關鍵基因PEPCK和G6Pase低表達從而抑制糖異生代謝。AMPK信號通路常被視為2型糖尿病潛在治療途徑[13]。

本研究通過PPI網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)多個多途徑參與糖尿病的重要蛋白。AKT1是細胞生長信號通路中的傳感器，AKT1作用在胰島素介導的信號轉導中，能夠防止胰島素受體去磷酸化，調節(jié)葡萄糖轉運環(huán)節(jié)。研究表明AKT1參與葡萄糖儲存環(huán)節(jié)，在血糖穩(wěn)態(tài)中扮演重要的角色。本研究發(fā)現(xiàn)的另一個重要蛋白胰島素受體是介導胰島素的關鍵蛋白。胰島素受體參與兩條主要信號通路[14]，在PI3K-AKT/PKB通路中調節(jié)胰島素代謝，在Ras/RAF/MAP2K/MAPK通路中調節(jié)胰島素的細胞生長、存活、分化，與葡萄糖的轉運和調節(jié)密切相關，是2型糖尿病發(fā)病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本研究篩選出了AKT參與的通路，也預測到了Ras信號通路，與文獻報道相符合。除此之外，還有PRKACA和PRARG蛋白分別參與了胰島素信號通路、AMPK信號通路，說明玉米須通過多種蛋白多途徑干預糖尿病。

4 結論

研究表明，玉米須的主要活性成分可針對多個靶點、多條通路發(fā)揮干預糖尿病的作用，其作用可能與胰島素信號通路、AMPK信號通路等有關，相關靶點及通路和現(xiàn)有的文獻報道較為一致。本研究還表明，草果知母湯的潛在作用靶點提示其在循環(huán)系統(tǒng)、癌癥、炎癥的治療中有一定的應用價值。盡管玉米須在最新版藥典中被剔除，市場各類以玉米須為原料的保健品、食品層出不窮，獲得了消費者的喜愛。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認為玉米須是安全、無毒的草本，玉米須提取物所制的藥品也被認為是非處方藥，受到國際認可。研究為進一步玉米須干預糖尿病作用機制相關研究提供參考依據(jù)，同時為藥食同源中藥的研究開發(fā)提供借鑒。局限性在于本研究是基于大數(shù)據(jù)網(wǎng)絡所做的預測，其降糖作用還需要通過進一步的實驗研究加以佐證。