補骨脂飲片的粉末均勻化研究*

張 競 ，楊君君 ，柴 欣 ，王躍飛 ，楊 靜

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 301617；2.滄州市中心醫(yī)院藥學部，滄州 061001）

補骨脂為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifoliaL.）的干燥成熟果實，主要產(chǎn)自云南、四川等地，是中國傳統(tǒng)中藥，臨床應用廣泛。補骨脂其性辛、苦，溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效[1]。近年來研究表明，補骨脂在抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]、抗炎[5]、調(diào)節(jié)雌激素水平[6]等方面均具有顯著的藥理作用。補骨脂鹽炙法收錄于2015版《中華人民共和國藥典》，補骨脂經(jīng)鹽炙可增強止瀉作用，降低燥性，降低毒副作用[1]。

現(xiàn)有的化學對照品、對照提取物無法完全反映出中藥飲片科學內(nèi)涵與特征屬性[7]。作為國家藥品標準物質(zhì)，中藥標準飲片的研究具有重要的意義。標準飲片的均勻化制備直接影響其內(nèi)涵特征的表達，其中粉碎工藝的優(yōu)化是標準飲片均勻化過程的重要環(huán)節(jié)之一[8]。補骨脂飲片粉末化研究有利于補骨脂飲片的質(zhì)量監(jiān)管。本文采用不同目數(shù)藥篩制備不同粒度的補骨脂飲片粉末，對其粉末分布及指標成分含量差異進行研究，并以粉碎時間、粉碎次數(shù)、投料量為因素，借鑒蛛網(wǎng)模式的研究方法[9-10]，通過出粉率、主要成分的總含量計算歸一化面積（S），采用正交實驗法以S為指標對影響因素進行研究，優(yōu)選最佳粉碎工藝，為制定補骨脂標準飲片粉末均勻化工藝的技術(shù)規(guī)范提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 超高效液相色譜儀：Waters ACQUITYTMUPLC system（美國沃特世公司），XS 205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），AL 204型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），SCIENTZ SB 25-12DTN型超聲波清洗器（寧波新芝生物有限公司，功率：300W，頻率：40 kHz），TGL-16C 型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），F(xiàn)W80粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），微量進樣器（平頭10 μL，上海高鴿工貿(mào)有限公司），硅膠G板（200 mm×100 mm，青島海洋化工分廠）。

1.2 藥品及試劑 對照品：補骨脂素（批號：110738-201313）、異補骨脂素（批號：110739-201115）購自中國食品藥品檢定研究院，純度為＞98%；補骨脂苷、異補骨脂苷（實驗室自制，NMR、MS鑒定化合物結(jié)構(gòu)，UPLC-UV分析純度＞98%）。甲醇、甲酸均為色譜純，食用鹽，水為超純水。

生補骨脂：補骨脂藥材購自河北安國藥材市場；鹽補骨脂：嚴格按照2015版《中華人民共和國藥典》鹽炙法（通則0213）炮制。

補骨脂是生補骨脂和鹽補骨脂的統(tǒng)稱；補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素分別簡寫為PO、IPO、P、IP。

2 方法

2.1 色譜條件 超高效液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇（B）-0.1%甲酸水（A）溶液，梯度洗脫（0～6 min，90% → 40%A）；柱溫：60℃；流速：0.3 mL/min；檢測波長：246 nm；進樣量：2 μL。

薄層色譜條件：按照2015版《中華人民共和國藥典》中薄層色譜法（通則0502）實驗，吸取樣品和對照品溶液各2～4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2 對照品溶液的配制 分別取PO、IPO、P、IP各5 mg，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL分別含有PO 0.798 mg、IPO 1.018 mg、P 1.140 mg、IP 1.284 mg 的儲備液，供定量分析用。

分別取P、IP對照品2 mg，精密稱定，加乙酸乙酯配制成每1 mL含P、IP各1 mg的混合對照品溶液，供薄層鑒別用。

2.3 供試品溶液的制備 取補骨脂粉末0.5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇適量，密塞，60℃超聲處理（功率300 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液 1 mL，加 1 mL 30%甲醇水溶液（V∶V），搖勻，供定量分析用[9]。

取補骨脂粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL三角瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，供薄層鑒別用[1]。

2.4 補骨脂飲片粉碎工藝正交實驗研究 以出粉率、指標成分的總含量為指標，借鑒蛛網(wǎng)模式的研究方法[10-11]，優(yōu)選最佳粉碎工藝。生補骨脂和鹽補骨脂中出粉率為Ga和G'a；PO、IPO、P、IP的總量為Za和Z'a，其中a為不同粉碎方式（9個正交實驗組，a為1～9）的補骨脂飲片粉末樣品。

為了消除不同指標取值范圍差異對統(tǒng)計結(jié)果的影響，對不同指標的變量進行歸一化處理。生補骨脂和鹽補骨脂樣品中最大出粉率為Ga（max）和G'a（max）；PO、IPO 和 P、IP 的最高總含量為 Za（max）和Z'a（max）。將不同指標的數(shù)值分別除以該指標的最大值，得到出粉率的歸一化結(jié)果分別為Qa和Q'a，PO、IPO和P、IP總量的歸一化結(jié)果分別為Ha和H'a。計算公式1、2如下所示。

通過計算Qa和Ha（Q'a和H'a）構(gòu)成的陰影部分面積，優(yōu)選生補骨脂和鹽補骨脂飲片的最佳粉碎方式，其歸一化面積分別為S和S'，計算公式3、4如下所示。

2.5 生補骨脂和鹽補骨脂飲片最佳粉碎工藝驗證研究 取生補骨脂和鹽補骨脂，采用補骨脂最佳粉碎工藝制備補骨脂標準飲片粉末，計算出粉率；按“2.3”項下方法制備補骨脂飲片粉末供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定供試品溶液中PO、IPO、P、IP的含量。

3 結(jié)果

3.1 補骨脂飲片的粉末分布及其指標成分的含量變化研究 分別取生補骨脂和鹽補骨脂各100 g，粉碎機單次粉碎20 s，采用《中國藥典》規(guī)定的標準藥篩制備不同目數(shù)的粉末，稱取不同藥篩上未通過該藥篩的樣品粉末質(zhì)量，分別計算其比例，結(jié)果見表1。按“2.3”項下方法處理樣品A～H（生補骨脂飲片粉末）和樣品A'～H'（鹽補骨脂飲片粉末），分別制備供定量分析用與供薄層鑒別用的樣品溶液，按“2.1”項下薄層色譜條件鑒別不同粒度的補骨脂飲片粉末，結(jié)果見圖1。按“2.1”項下色譜條件測定供試品溶液中PO、IPO、P、IP的含量，結(jié)果見圖2。

表1 不同補骨脂飲片粉末質(zhì)量分布結(jié)果Tab.1 The results of powder weight distribution for different Fructus Psoraleae

表1結(jié)果顯示，100%補骨脂飲片粉末通過10目篩，89.02%生補骨脂粉末和97.34%鹽補骨脂粉通過24目篩，56.24%生補骨脂粉末和62.40%鹽補骨脂粉通過50目篩。由圖1、2可知，補骨脂飲片中P、IP、PO、IPO 4個指標成分的質(zhì)量隨著標準篩目數(shù)的改變而變化，補骨脂飲片不同目數(shù)標準篩上的粉末中PO、IPO含量隨著標準篩目數(shù)增加而減少，P、IP的含量隨著標準篩目數(shù)增加而增加；薄層色譜結(jié)果顯示P、IP的熒光斑點隨著標準篩目數(shù)增加而增強，與含量測定趨勢一致。

圖1 不同生補骨脂飲片粉末（A）、鹽補骨脂飲片粉末（B）薄層色譜圖Fig.1 The thin-layer chromatography of the powder from raw Fructus Psoralea（A）and from salt-processed Fructus Psoraleae（B）

圖2 不同補骨脂飲片粉末質(zhì)量（A）、指標成分含量（B）及指標成分質(zhì)量（C）的柱狀圖Fig.2 The histograms of powder weight（A），target components content（B）and target components mass（C）from Fructus Psoraleae

補骨脂飲片由果皮和種子組成，補骨脂果皮主要含有P、IP等脂溶性成分，易粉碎；補骨脂種子主要含有PO、IPO，質(zhì)地堅硬不易粉碎[12]。因此，粒度越小的飲片粉末主要為補骨脂果皮粉末（易粉碎），P、IP含量較高；越大的飲片粉末主要為種子粉末（不易粉碎），PO、IPO含量較高，P、IP含量較低。

3.2 補骨脂飲片粉碎工藝正交實驗研究 結(jié)合“3.1”的結(jié)果和《中國藥典》補骨脂項下相關(guān)規(guī)定，采用標準三號藥篩（50目）篩取制備補骨脂標準飲片粉末，按“2.3”項下方法制備補骨脂飲片粉末供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定供試品溶液中指標成分的含量。按“2.4”項下方法，以粉碎時間、粉碎次數(shù)、投料量（以投料藥材占粉碎室的體積計）為因素，以出粉率、化合物含量為指標進行正交實驗，優(yōu)選最佳粉碎工藝，測定結(jié)果見表2。

表2 補骨脂飲片粉碎工藝正交實驗表Tab.2 The orthogonal experiment table of pulverization process for Fructus Psoraleae

通過正交實驗設(shè)計助手對實驗數(shù)據(jù)進行分析，以歸一化面積（S）為指標進行評價，考察不同因素對生補骨脂飲片研究結(jié)果的歸一化面積的影響為：B＞A＞C，最佳粉碎工藝為A2B3C1，即投料量為1/4粉碎室的體積，單次粉碎時間30 s，粉碎3次，過50目篩，即得；考察不同因素對鹽補骨脂飲片研究結(jié)果的歸一化面積的影響為：B＞C＞A，最佳粉碎工藝為A2B2C2，即投料量為1/3粉碎室的體積，單次粉碎時間30 s，粉碎2次，過50目篩，即得。測定結(jié)果見圖3。

3.3 生補骨脂和鹽補骨脂飲片最佳粉碎工藝驗證研究 按“2.5”項下方法，采用最佳粉碎工藝制備的生補骨脂飲片的出粉率97.42%，RSD為0.02%（n=3）；PO、IPO、P、IP 的總含量為 0.127 8 mmol/g，RSD為0.77%（n=3），說明生補骨脂最佳粉碎工藝穩(wěn)定、可行。采用最佳粉碎工藝制備的鹽補骨脂飲片的出粉率 97.15%，RSD 為 0.35%（n=3）；PO、IPO、P、IP 的總含量為 0.130 6 mmol/g，RSD 為 1.71%（n=3），說明鹽補骨脂最佳粉碎工藝穩(wěn)定、可行。

4 結(jié)論

本實驗借鑒蛛網(wǎng)模式的研究方法，通過出粉率、指標成分的總含量計算歸一化面積（S），采用正交實驗法以S為指標對補骨脂飲片進行粉末均勻化工藝研究，經(jīng)粉碎工藝放大驗證，該方法可行。

圖3 基于“蛛網(wǎng)模式”研究方法計算的補骨脂飲片粉碎工藝研究結(jié)果的歸一化面積
Fig.3 Normalized area of research results of pulverization process for Fructus Psoraleae based on“Spider-web”mode