西洋參不同部位皂苷成分研究*

劉俊文，徐美利，徐 冰，牛志平，高 偉，連運(yùn)河，喬延江

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥信息工程研究中心，北京 100029；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，邯鄲 057250）

西洋參（Panax quinquefoliumL.）為五加科人參屬多年生草本植物，又稱花旗參，洋參等，其性涼，味甘、微苦，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效。原產(chǎn)于與美國的威斯康辛州，中國北京懷柔、吉林長白山、山東文登等地均有種植。近年來，關(guān)于西洋參的研究報(bào)道較多，無論是其地上部分還是地下部分均有很高的藥用價(jià)值。西洋參中主要有效成分是三萜皂苷，具有抗腫瘤、抗癌、降血壓、降血脂、抗疲勞等多方面的藥理活性[1]。中國西洋參雖然產(chǎn)量較大，但是仍滿不足了國內(nèi)需求，需要從國外進(jìn)口。筆者通過對西洋參不同部位皂苷的含量測定，明確了各部位皂苷含量，為西洋參綜合利用與開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-1102型紫外可見分光光度計(jì)（上海譜元儀器有限公司），W2-100sp型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海中生科技有限公司），HHS-21-4水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），KQ-500DA型超聲波清洗（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)W135型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）

1.2 材料 甲醇、乙腈、正丁醇、石油醚均為分析純，購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品 Rg1（批號 110703-201832）、Re（批號110754-201827）、Rb1（批號 111818-201603）、Rc（批號 R-008-120628）、Rb2（批號 111715-201203）、Rb3（批號111686-201504）、Rd（批號 111818-201603），均購于中國食品藥品檢定研究院；整株西洋參購自山東文登地區(qū)，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒別為五加科植物西洋參（Panax quinquefoliumL.）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱（250 mm×3 mm，5 μm）流動相為 A：乙腈；B：0.1%磷酸水溶液，洗脫梯度：0～25 min，19%～20%A；25～60 min，20%～40%A；60～65 min，40%～19%A；檢測波長為 203 nm；柱溫 40℃；進(jìn)樣量為 10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 適量，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，分別制成濃度為0.958、0.265、0.993、0.978、0.971、0.972、0.231 mg/mL 的混合對照品溶液，搖勻，然后用0.45 μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取西洋參全草若干，并將各部位（花蕾、莖、葉、蘆頭、主根、側(cè)根、須根、參皮、參芯）分離，粉碎，過40目篩，精密稱取1.000 g，將各部位粉末用300目濾布包裹，加適量石油醚超聲30 min，去除葉綠素及脂肪。取出，將石油醚揮干，加80%甲醇回流提取4次，每次用量30 mL，每次提取30 min。將4次提取液合并，濃縮蒸干，加適量蒸餾水溶解殘?jiān)?，并用蒸餾水洗滌容器，將以上溶液合并（約30 mL）；將合并液置于分液漏斗中，用正丁醇萃取3次，每次用量10 mL，合并正丁醇萃取液，置于分液漏斗中，用20 mL蒸餾水洗滌；將洗滌后的正丁醇溶液蒸發(fā)至干，用適量甲醇溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得供試溶液[2]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取含7種皂苷的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2、6、10、14、20 μL 注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

表1 7種人參皂苷線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.1 Linearity regression equations of 7 ginsenosides

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，記錄峰面積，計(jì)算人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 的 RSD 分別為0.68%、0.72%、0.64%、0.57%、0.45%、0.50%、0.47%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取西洋參葉供試樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下條件處理后，進(jìn)行含量檢測，其人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 的 RSD 分 別 為1.1%、0.52%、1.9%、1.1%、0.61%、0.48%、0.66%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取西洋參葉供試樣品，在室溫條件下放置，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的RSD 分別為 1.7%、0.91%、1.90%、1.05%、0.75%、0.69%、0.81%，表明樣品中的各人參皂苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率精密 稱取已知含量的西洋參葉供試樣品6份，加入一定量的人參皂苷混合標(biāo)品，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率（n=6）Tab.2 Sample recovery rate（n=6）

2.4.6 西洋參各部位含量測定 結(jié)果取西洋參各部位，參照“2.3”項(xiàng)下條件制備樣品，進(jìn)高效液相色譜并測定各皂苷含量，測定結(jié)果見表3，對照品和西洋參各部位圖譜見圖1。

2.5 主成分分析 采用SIMCA 13.0軟件進(jìn)行主成分分析。本實(shí)驗(yàn)選取了兩個(gè)主成分，其特征值分別為4.27、1.74，均大于1，累積方差貢獻(xiàn)率為85.8%，即這兩個(gè)主成分可以代表7個(gè)指標(biāo)在9種部位中的85.8%的信息。載荷量表示主成分與對應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)[3]，其值越大，表明該成分在主成分分析中作用越大，如圖2載荷圖所示，人參皂苷Re和Rd對第一主成分的影響最大，而人參皂苷Rb1對于第二主成分影響最顯著。

表3 西洋參各部位皂苷含量（x±s，n=3）Tab.3 The contents of saponins in different parts of Panax quinquefolium（x±s，n=3）

圖1 人參皂苷對照品及西洋參不同部位HPLC圖Fig.1 HPLC chromatography of ginsenoside reference substances and different parts of Panax quinquefolium L.

圖2 載荷圖Fig.2 Loading plots

2.6 聚類分析 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間聯(lián)接的方法，以7種人參皂苷成分為變量對西洋參9個(gè)部位進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示，當(dāng)距離為25時(shí)，可聚為兩類，第一類：花蕾和葉，第二類：側(cè)根、參皮、主根、參芯、莖、蘆頭和須根；當(dāng)距離為15時(shí)，可聚為4類，第一類：花蕾和葉，第二類：須根和蘆頭，第三類：主根、參芯及莖，第四類：側(cè)根、參皮。結(jié)合主成分得分圖（圖4），S1和S9距離較近，其成分相近，成為一類，S2～S8分布較為集中，可成為一類，此結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 西洋參不同部位聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis of different parts of Panax quinquefolium L.

圖4 得分圖Fig.4 Score plots

3 討論

通過西洋參各部位皂苷檢測，各部位均含有一定量的人參皂苷，西洋參地上部分花蕾和葉中總皂苷含量均較高，分別為9.74%和6.54%，其含量較多的皂苷為Rb3，其具有腦保護(hù)、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)、心血管保護(hù)、抗抑郁和抗糖尿病等功效[4]，西洋參地上部分資源量豐富，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值；地下部分總皂苷含量從高到低依次是須根、蘆頭、側(cè)根、參皮、參芯、主根。人參皂苷Rb1和Re在各部位均較高，其中Rb1可通過多種途徑對心肌缺血具有保護(hù)作用，并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病有一定的治療作用[5]。Re也具有相同功效，并具有降糖和抗休克等作用。

通過主成分分析和聚類分析，花蕾和葉成為一類，它們作為西洋參地上部分，其人參皂苷組分較為相近，而他們與莖組分含量卻差異較大，且莖中各皂苷含量均較少，此結(jié)果可以為西洋參地上部分資源的合理利用作指導(dǎo)；西洋參地下部位自成一類，它們大多皂苷含量較多，且成分組成較為接近，為西洋參資源利用的主要來源。

西洋參皂苷是西洋參中最主要的有效成分之一，也是生理活性最顯著的物質(zhì)，廣泛分布于各個(gè)部位。由于生長環(huán)境的不同，如土壤類型、氣候條件的不同，會使有效成分類型及含量分布出現(xiàn)較大差異[6]，通過西洋參各部位皂苷含量分析，明確各部位含量差異，可選擇性的對含量較高的部位進(jìn)行提取分離，并應(yīng)用于新藥開發(fā)[7]，對于其資源的綜合利用有重要意義。