硫化氫對自發(fā)性高血壓大鼠心肌重構(gòu)的作用及機制研究*

張曉景，王童，孔繁秀，劉宇航，陳宇鑫，張亮，李玲，司軍強

[石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1.生理教研室（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室），2.醫(yī)學(xué)教學(xué)實驗中心，新疆 石河子832000]

心臟作為高血壓直接損傷的靶器官之一，最顯著的特征性病理變化是心肌肥厚，以左心室肥厚最為明顯[1]。高血壓所致的心室壁增厚和心室?guī)缀螛?gòu)型改變稱為高血壓心肌重構(gòu)。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rat,SHR）的肥厚心肌中間隙連接蛋白43（connexin 43,Cx43）表達(dá)上調(diào)且分布紊亂[2]。硫化氫H2S 可改善由亞硝基左旋精氨酸甲酯（l-nitro-arginine methyl ester,L-NAME）誘導(dǎo)的高血壓性心臟病[3]，可抑制腎血管性高血壓大鼠的心肌重構(gòu)[4]，還可以抑制大鼠因高鹽飲食導(dǎo)致的心肌肥厚[5]。然而H2S 是否通過間隙連接蛋白影響心肌重構(gòu)的研究甚少，因此，本文以SHR為研究對象，應(yīng)用分光光度計檢測硫氫化鈉NaHS 對外周血及心肌組織中內(nèi)源性H2S 含量的影響，應(yīng)用蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色及馬松（Masson）三色染色觀察心肌重構(gòu)情況，通過免疫組織化學(xué)檢測H2S 對間隙連接蛋白40（Connexin 40,Cx40）、Cx43表達(dá)的影響；通過Western blotting 檢測H2S 對Cx40、Cx43 及α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，由此來探討H2S 對心肌重構(gòu)的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取8 周齡SHR 雄鼠16 只和同齡Wistar 京都（Wistar-Kyoto,WKY）雄鼠8 只，清潔級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[動物合格證號：SCXK（京）2016-0006]，動物適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后進(jìn)入實驗，動物房室內(nèi)溫度為20 ～25℃，濕度為50%～ 55%。大鼠分籠喂養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食水，環(huán)境安靜。

1.2 主要試劑

NaHS（美國索萊寶公司），H2S 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），Masson 三色染色試劑盒、HE 試劑盒（北京索萊寶公司），Cx43 抗體、OPN 抗體（英國Abcam 公司），Cx40 抗體、α-SMA 抗體（美國Bioworld 公司）。

1.3 主要儀器

全自動大小鼠無創(chuàng)血壓測量儀（四川成都泰盟公司），光學(xué)顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），臺式高速低溫離心機（德國Eppendorf 公司），分光光度計（德國Eppendorf 公司），電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及模型復(fù)制將實驗動物分為SHR對照組、SHR+NaHS 組和WKY 組，每組8 只。SHR+ NaHS 組腹腔注射NaHS 56 μmol/（kg·d），SHR 對照組和WKY 組每日腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)8 周。

1.4.2 動物血壓測量使用全自動大小鼠無創(chuàng)血壓測量儀測量WKY 大鼠和SHR 尾動脈收縮壓。使用前預(yù)熱15～20 min，將大鼠尾根部套在血壓計的充氣尾套內(nèi)，待大鼠安靜后重復(fù)測量3 次，取平均值。

1.4.3 大鼠外周血及心肌組織H2S 含量的測量大鼠稱重后腹腔注射水合氯醛麻醉，立即抽取外周血，同時取出心臟，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）將大鼠心臟漂洗干凈，按試劑盒說明書步驟測量外周血及心肌組織中H2S 的含量。

1.4.4 大鼠心肌病理形態(tài)及心肌纖維化程度的觀察用手術(shù)刀將大鼠心臟縱切成片，置于甲醛中固定48 h，制成4 μm 厚的石蠟切片，烘干后經(jīng)過脫蠟、蘇木 精染色、藍(lán)化、伊紅染色、脫水、中性樹膠封片、鏡檢等步驟完成HE 染色；經(jīng)過脫蠟、鐵蘇木精染色、酸性乙醇分化、Masson 藍(lán)化液返藍(lán)、麗春紅染色、磷鉬 酸退紅、苯胺藍(lán)染色、脫水、透明、中性樹膠封片、鏡 檢等步驟完成Masson 三色染色；光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌病理形態(tài)和心肌纖維化改變。

1.4.5 大鼠心肌組織中Cx40、Cx43 的表達(dá)檢測對石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、過氧化氫孵育、一抗孵育過夜、二抗孵育、DAB 溶液顯色、蘇木精復(fù)染、酸酒精分化、自來水藍(lán)化、脫水、中性樹膠封片、鏡檢等步驟完成免疫組織化學(xué)染色，觀察Cx40、Cx43的表達(dá)變化。

1.4.6 Western blotting 檢測大鼠心肌組織中Cx40、Cx43、α-SMA、OPN 的表達(dá)心肌組織提取蛋白后，經(jīng)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃孵育過夜、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯色、曝光、采集圖像后分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism（Version 5）統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，方差分析的兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尾動脈收縮壓的比較

3 組大鼠的尾動脈收縮壓比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=241.800，P=0.038）。與WKY 組大鼠（99.150± 3.371）mmHg 比較，SHR 對照組尾動脈壓（167.600± 2.117）mmHg 升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），SHR+ NaHS 組大鼠尾動脈壓（107.900±1.175）mmHg 較SHR 對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 NaHS 對SHR 尾動脈收縮壓的影響 （n=8，±s）

2.2 各組大鼠外周血及心肌H2S 含量比較

3 組大鼠的外周血和心肌H2S 含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=764.300 和11.950，P=0.001 和0.008）。SHR 對照組大鼠外周血和心肌H2S 含量較WKY 組降低[（50.460±0.120）VS（53.920±0.243）μmol/L，（0.462±0.004）VS（0.508±0.004）μmol/g]（P＜0.05）；SHR+NaHS 組外周血及心肌中H2S 含量較SHR 對照組升高[（50.460±0.120）VS（59.070±0.003）μmol/L，（0.462±0.004）VS（0.538±0.018）μmol/g]（P＜0.05）。見圖2。

圖2 NaHS 對SHR 外周血和心肌中H2S 含量的影響 （n=8，±s）

2.3 各組大鼠心肌HE 染色及Masson 三色染色結(jié)果比較

HE 染色結(jié)果示W(wǎng)KY 組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，間距明顯，排列整齊，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整且排列規(guī)則，未見細(xì)胞變性和炎癥細(xì)胞浸潤；SHR 對照組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂堆積，細(xì)胞核破碎較多且排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤；SHR+NaHS 組大鼠心肌纖維排列較整齊，細(xì)胞核較完整且排列較規(guī)律。見圖3。

Masson 三色染色結(jié)果顯示，心肌中細(xì)胞核、膠原纖維和膠原蛋白染成藍(lán)色或綠色，細(xì)胞漿、肌肉和紅細(xì)胞染成紅色，SHR 對照組較WKY 組大鼠間質(zhì)藍(lán)色膠原纖維增多，NaHS 干預(yù)后間質(zhì)藍(lán)色膠原纖維有所減少。見圖3。

2.4 各組大鼠的Cx40、Cx43 表達(dá)情況

WKY 組大鼠的Cx40、Cx43 表達(dá)位置集中在心肌閏盤處，SHR 對照組大鼠的Cx40、Cx43 表達(dá)上調(diào)且在心肌表面隨機分布，不局限于心肌閏盤處；SHR+NaHS組與SHR 對照組比較，其Cx40、Cx43 蛋白表達(dá)有所減少且分布較有規(guī)律性。見圖4。

圖3 NaHS 對SHR 心肌纖維和細(xì)胞核的影響

2.5 各組大鼠心肌組織中Cx40、Cx43、α-SMA及OPN 的蛋白表達(dá)量的比較

WKY 組、SHR 對照組和SHR+NaHS 組大鼠心肌組織中Cx40、Cx43、α-SMA 及OPN 的蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與WKY 組大鼠比較，SHR 對照組Cx40、Cx43、α-SMA 及OPN 表達(dá)增強（P＜0.05），NaHS 干預(yù)后Cx40、Cx43、α-SMA及OPN 表達(dá)減弱（P＜0.05）。見表1 和圖5。

圖4 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43 表達(dá)的影響 （免疫組織化學(xué)×400）

表1 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43、α-SMA 和OPN 蛋白表達(dá)的影響 （n=8，±s）

表1 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43、α-SMA 和OPN 蛋白表達(dá)的影響 （n=8，±s）

注：?與SHR 對照組比較，P＜0.05

組別 Cx40 Cx43 α-SMA OPN WKY 組 1.047±0.023? 0.983±0.008? 0.981±0.010? 0.995±0.003?SHR 對照組 1.458±0.013 1.158±0.013 1.165±0.010 1.082±0.001 SHR+NaHS 組 1.228±0.009? 0.919±0.004? 1.042±0.002? 0.854±0.012?F值 106.600 175.000 127.300 253.000P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 NaHS 對SHR 心肌中Cx40、Cx43、α-SMA 和OPN 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

心肌纖維化是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，高血壓的長期刺激使心肌間質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)適應(yīng)性增生改變，產(chǎn)生間質(zhì)纖維化，是心肌缺血、心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病的危險因素[6-7]，心肌纖維化及心肌重構(gòu)存在于SHR 的整個高血壓階段，且隨著鼠齡的增加而逐漸加重[8]，本實驗通過HE 染色及Masson 染色也證明SHR發(fā)生心肌纖維化及心肌重構(gòu)。心肌細(xì)胞中OPN 蛋白的過量表達(dá)會導(dǎo)致心肌組織嚴(yán)重纖維化，心肌細(xì)胞斷裂變性，心室重構(gòu)的發(fā)生[9]；OPN 敲除可減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化和心室重構(gòu)[10]；在大量生長因子和細(xì)胞因子的作用下，成纖維細(xì)胞表達(dá)大量的α-SMA并分泌大量的膠原蛋白，引起心臟纖維化，在梗死區(qū)可以檢測到大量α-SMA 表達(dá)，提示α-SMA 參與心肌梗死后心臟受損和心室重構(gòu)的過程[11]。以上研究表明，OPN、α-SMA 的蛋白表達(dá)量與心肌纖維化及心室重構(gòu)呈正相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)SHR 心肌中的OPN、α-SMA 表達(dá)升高，進(jìn)一步驗證SHR 發(fā)生心肌纖維化及心肌重構(gòu)。

間隙連接是心肌細(xì)胞之間主要的連接方式，大多存在于閏盤處，在心血管系統(tǒng)中間隙連接蛋白的表達(dá)及功能異常與各種心血管疾病相關(guān)，多項研究發(fā)現(xiàn)在缺血性心肌病、心肌肥厚及心力衰竭的發(fā)病過程中伴隨著間隙連接/Cx43 的重構(gòu)。據(jù)報道心房的快速起搏能誘發(fā)左心房組織心肌纖維化和Cx40 表達(dá)升高，同時發(fā)現(xiàn)心房心肌纖維化的程度影響Cx40 的改變程度[12]；有研究表明，SHR 的心肌肥厚中Cx43 表達(dá)上調(diào)[2]；另有研究顯示，降低小鼠心室肌Cx43基因表達(dá)可增強纖維細(xì)胞的活化，導(dǎo)致心肌纖維化增多，提示恢復(fù)Cx43 功能也可能影響心肌重構(gòu)[13]。以上研究表明，間隙連接蛋白的表達(dá)與心肌纖維化之間存在不同的相關(guān)性，這可能與實驗所取心臟的部位有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，SHR 心肌中Cx40、Cx43 蛋白表達(dá)升高，同時伴有心肌纖維化程度的增強，表明間隙連接蛋白的表達(dá)與心肌纖維化之間存在著密切的關(guān)系。

H2S 對維持心血管穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵性的作用[14]，有研究表明SHR 主動脈H2S 的生成量低于WKY 組大鼠[15]，給予SHR 外源性H2S 可以降低大鼠動脈血壓，且可減少心肌中膠原含量，進(jìn)而改善SHR 心肌中膠原的堆積，緩解心肌重構(gòu)[16-17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，SHR 外周血及心肌組織中H2S 的含量低于WKY 組大鼠，NaHS 干預(yù)后H2S含量增加，同時NaHS 干預(yù)組大鼠的血壓降低，心肌組織中膠原堆積減少，心肌重構(gòu)得到抑制。有研究報道糖尿病大鼠心肌組織Cx43 在基因、蛋白水平上的表達(dá)均有不同程度下降，而H2S 可上調(diào)Cx43 mRNA 表達(dá)，提高Cx43 蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而改善細(xì)胞間的傳導(dǎo)[18]；H2S 可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，同時上調(diào)Cx40 蛋白的表達(dá)，可能參與糖尿病大鼠的心肌纖維化和縫隙連接重構(gòu)的調(diào)控[19]。而本研究發(fā)現(xiàn)SHR 組心肌組織中Cx40、Cx43 蛋白表達(dá)較WKY 組大鼠增加，給予NaHS 可以降低Cx40、Cx43 的蛋白表達(dá)，同時可改善SHR 心肌重構(gòu)，因此推測H2S 可能是通過調(diào)控間隙連接蛋白的表達(dá)來緩解心肌重構(gòu)，但其機制尚不明確，近期研究發(fā)現(xiàn)H2S 可對特異蛋白進(jìn)行巰基化修飾，將某些功能蛋白（如KATP 通道、腺苷酸環(huán)化酶、MAPKs）中半胱氨酸殘基的-SH 轉(zhuǎn)變?yōu)?S-SH，從而使蛋白活性提高[20]；這種翻譯后修飾是機體實現(xiàn)心血管保護的重要機制[21]；且H2S 通過激活由鈣通道介導(dǎo)的AKT/eNOS/NO 通路來改善由L-NAME 誘導(dǎo)的高血壓性心臟病[3]，另外，H2S 可能通過TGF-β1/Smad 信號通路來抑制SHR 心肌中膠原合成[17]。因此，筆者推測H2S 可能是通過巰基化修飾來增強縫隙連接蛋白活性從而起到緩解心肌重構(gòu)的作用，同時也可能受上述信號通路的影響，然而這一推測有待于進(jìn)一步驗證。