高效液相色譜

費(fèi)騰 付雪俠 王勇 趙亞坤 李丹

摘 要：建立一種高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法測定3種葡萄汁中果糖、葡萄糖、蔗糖含量的方法。采用ZORBAX Carbohydrate（4.6mm×150mm 5μm）色譜柱，乙腈水（80：20）流動相，氮?dú)猓?.8L/min）輔氣，漂移管溫度為100℃。結(jié)果表明：在該條件下，3種糖組分在15min內(nèi)都能夠較好地分離，利用外標(biāo)法測得 “白玫瑰”、“紅寶石”、“巨峰”果糖含糖量分別為14.19%、14.70%、13.30%，葡萄糖含量分別為10.36%、9.08%、8.70%，“巨峰”蔗糖含量為2.4%，另2種葡萄未檢出蔗糖?！熬薹濉钡墓?、葡萄糖含量對“白玫瑰”和“紅寶石”具有差異性（P<0.05）。該方法具有操作簡單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，是測定葡萄汁中糖含量的理想方法。

關(guān)鍵詞：葡萄汁;HPLC—ELSD;果糖;葡萄糖;蔗糖;含量測定

中圖分類號：S-33

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190630002

葡萄品種繁多，在中國約有800多種?！鞍酌倒濉庇置麧捎?，皮薄，果粒飽滿，肉質(zhì)細(xì)軟，酸甜適口。“紅寶石”，原產(chǎn)美國，1987年引入中國，果皮薄，果肉脆，無核，味甜爽口?！熬薹濉?，原產(chǎn)日本，1959年引入中國，為主栽品種之一，粒大果皮厚，果肉較軟，味甜、多汁，有草莓香味。均屬于市面常見的葡萄品種。

葡萄是營養(yǎng)價(jià)值極高的水果，葡萄中含有大量糖、氨基酸、維生素、花青素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，也含有黃酮類化合物、白藜蘆醇等生物活性成分[1]。常食葡萄對神經(jīng)衰弱、疲勞過度大有裨益，能“清洗”血液，防止膽固醇斑塊的形成，減少心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，有益于那些局部缺血性心臟病和動脈粥樣硬化心臟病患者的健康[2]。

糖是葡萄汁中的最主要的成分，據(jù)現(xiàn)代藥理研究證明，當(dāng)人體出現(xiàn)低血糖時(shí)，若及時(shí)飲用葡萄汁，可使癥狀得到緩解。

糖的種類和含量決定葡萄汁營養(yǎng)品質(zhì)和感官品質(zhì)，在葡萄汁中一般可以品出味道的糖類有葡萄糖、果糖、蔗糖等，這些糖分在不同品種葡萄中含量各不相同，研究葡萄汁中糖組分含量情況，為民眾日常選擇食用葡萄汁提供科學(xué)依據(jù)。

糖類含量的測定，通常采用苯酚硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法、蒽銅法等分光光度比色法，但是只能測定總糖的含量。為了測定糖的單個(gè)組分含量，采用高效液相色譜柱分離、再經(jīng)檢測器定量，是目前比較常用的方法;由于果糖、葡萄糖、蔗糖等沒有紫外吸收，不能采用紫外檢測;可以使用示差折光檢測器（RID）[3]與高效液相色譜（HPLC）聯(lián)機(jī)進(jìn)行測定。但是此方法存在靈敏度低，系統(tǒng)平衡時(shí)間較長，要求恒溫、恒流速、基線噪音大，且無法使用梯度洗脫等缺點(diǎn)。也可以使用電化學(xué)檢測器（ECD）[4]，此方法檢出限低，但對樣品的前處理要求較高，難以祛除的雜質(zhì)會在電極表面氧化，導(dǎo)致峰面積和峰高的變化，影響定量分析的準(zhǔn)確性。

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）作為新一代通用型質(zhì)量檢測器，對有質(zhì)量的物質(zhì)都能檢測，對沒有紫外吸收、電活性的物質(zhì)以及產(chǎn)生末端紫外吸收的物質(zhì)均能產(chǎn)生響應(yīng)。蒸發(fā)光散射檢測器在測量半揮發(fā)或不揮發(fā)樣品的光散射之前首先把流動相蒸發(fā)掉，所以檢測器的響應(yīng)不受溶劑和樣品特殊性質(zhì)的影響，彌補(bǔ)了高效液相色譜傳統(tǒng)檢測器的不足[5-8]。

目前用高效液相色譜測定葡萄汁中糖含量的研究相對較少，本研究采用高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測法來測定種葡萄汁中糖的含量，建立了一種操作簡單、快速、直接測定葡萄汁中糖含量的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與化學(xué)試劑

果糖、葡萄糖、蔗糖（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司），乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），水。

為高純水，流動相經(jīng)0.2μm 濾膜過濾（聚醚砜，MEMBRANA公司，德國）。

葡萄樣品：“白玫瑰”，“紅寶石”，“巨峰”，市售（均產(chǎn)自遼寧省熊岳縣）。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的配置

樣品溶液制備：精確稱取150g葡萄，分別放入高速組織搗碎機(jī)（HGB2WTS3，Waring，美國）中進(jìn)行榨汁，時(shí)間為3min，將葡萄汁放入離心管，離心機(jī)（Beckman 美國）的轉(zhuǎn)子為JA25.5，轉(zhuǎn)速9000g，4℃進(jìn)行離心20min，取上清液，用濾紙進(jìn)行1次抽濾得到原汁液。用蒸餾水稀釋100倍，然后以0.45μm孔徑的微孔濾膜（聚醚砜，MEMBRANA公司，德國）過濾。濾液供HPLC-ELSD分析。

1.2.2 色譜條件和蒸發(fā)光散射器參數(shù)

高效液相色譜儀（Dionex P680 HPLC pump，美國）;ZORBAX Carbohydrate色譜柱（安捷倫4.6mm×150mm#5-Micron，美國）;流動相，乙腈：水（80：20v/v）;流速，1.0mL/min;柱溫：30℃;蒸發(fā)光散射檢測器（Alltech 3300 ELSD，美國）條件： 漂移管溫度：100℃，氮?dú)鉃檩o氣（流量：1.8L/min）;進(jìn)樣體積：20μL。

1.2.3 色譜峰的確定

稱取各標(biāo)準(zhǔn)品25mg，分別溶于50mL容量瓶中，分別在1.2.2色譜條件下進(jìn)樣，記錄各標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，混標(biāo)色譜圖與之相比較，根據(jù)保留時(shí)間確定各色譜峰成分。

1.3 樣品含量測定與計(jì)算

根據(jù)混合樣品各組分糖的保留時(shí)間確定樣品中的組分，根據(jù)峰面積，采用外標(biāo)法，計(jì)算樣品中各組分糖含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS（IBM SPSS Statistics 23.0）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。數(shù)據(jù)表示為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差，采用LSD法對3個(gè)品種葡萄汁的果糖含量和葡萄糖含量進(jìn)行多重比較（P<0.05）。