益氣活血復(fù)方對心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝的影響*

劉秀娜，張　艷，禮　海（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽00；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽00；.沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院，沈陽00）

·實驗研究·

益氣活血復(fù)方對心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝的影響*

劉秀娜1，張艷2，禮海3
（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽110032；3.沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院，沈陽110101）

［目的］觀察益氣活血復(fù)方對心肌梗死后慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌能量代謝的影響。［方法］選用SPF級健康雄性SD大鼠80只，隨機選取20只為空白對照組，其余60只大鼠采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法配合力竭式游泳及節(jié)食方法復(fù)制慢性心力衰竭大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機分為中藥組、西藥組及模型組?？瞻讓φ战M與模型組給予常規(guī)等容積蒸餾水灌胃，每日1次，中藥組按生藥9.2 g/（kg·d）劑量給予益氣活血復(fù)方灌胃，每日1次，西藥組按生藥1.5 mg/（kg·d）劑量給予賴諾普利灌胃，每日1次。持續(xù)給藥28 d后，禁食不禁水12 h，取心肌組織及血漿。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測B型腦尿鈉肽（BNP）濃度，比色法檢測三磷酸腺苷（ATP）濃度；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和免疫蛋白印跡法檢測過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC-1α）基因和蛋白的表達。［結(jié)果］與空白對照組比較，模型組、中藥組、西藥組PGC-1α mRNA、蛋白表達及ATP濃度降低，BNP濃度升高，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組和西藥組PGC-1α mRNA、蛋白表達及ATP濃度升高，BNP濃度降低，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。中藥組與西藥組PGC-1α mRNA、蛋白表達及ATP濃度、BNP濃度無明顯差異，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。［結(jié)論］益氣活血復(fù)方可通過激活與心肌能量代謝有關(guān)的PGC-1α因子，增加線粒體的產(chǎn)能，以此來改善和糾正心力衰竭。

益氣活血復(fù)方；慢性心力衰竭；PGC-1α；三磷酸腺苷；B型腦尿鈉肽

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.01.07

現(xiàn)研究認(rèn)為，能量代謝障礙是貫穿于心臟從代償性肥大到衰竭的重要因素之一。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1（PGC-1），是一種通用核受體輔助激活因子，主要在能量代謝中起作用。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC-1α）是PGC-1的主要成員之一，被認(rèn)為是線粒體生物發(fā)生的主導(dǎo)協(xié)調(diào)因子，在線粒體增長中發(fā)揮了作用［1］。益氣活血復(fù)方是吾師張艷在臨床從醫(yī)30余年總結(jié)出來的經(jīng)驗方藥之一，在臨床治療慢性心力衰竭（CHF）上具有較好的療效。由此，本研究通過觀察對益氣活血復(fù)方對CHF大鼠心肌能量代謝的影響，為中醫(yī)藥治療CHF提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料及方法

1.1實驗動物SPF級12周健康SD大鼠80只，雄性，體質(zhì)量為（250±10）g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（遼）2010-0001。

1.2藥物、試劑與儀器益氣活血復(fù)方（由黃芪、太子參、紅花、丹參、益母草、茯苓、葶藶子組成），由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供和制備，處方中全部藥材均符合《中華人民共和國藥典》2005年版相關(guān)規(guī)定，含生藥0.4 g/mL。賴諾普利片，由上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，每片10 mg，批號：HI0960265。DNA maker、PGC-1α PCR試劑盒購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。Trizol，購自Invitrogen公司。B型腦尿鈉肽（BNP）試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。三磷酸腺苷（ATP）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。HX-300小動物呼吸機，由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。SONO S5500彩色多普勒超聲機，由Agilnet公司生產(chǎn)，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀7500型，由美國Agilnet公司生產(chǎn)。

1.3心力衰竭大鼠造模隨機選取20只未予任何處理的正常大鼠為空白對照組（以下簡稱空白組）。其余60只正常大鼠參照參考文獻［2］制備CHF大鼠模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉大鼠，將麻醉后大鼠取仰臥位于實驗臺固定好，行經(jīng)喉氣管插管術(shù)連接小動物呼吸機（頻率為每分鐘80次，潮氣量為0.8 mL）。于大鼠左胸被皮，經(jīng)碘伏消毒后在其左側(cè)第3、4肋間橫向剪開皮膚，按照肌肉的走行方向進行逐層鈍性分離軟組織至肋間肌層，再沿第3肋間打開胸腔，按照心臟的解剖特征在左心耳和肺動脈圓錐之間找到左冠狀動脈前降支，于其起點下2～4 mm處用醫(yī)用美容線結(jié)扎至周圍心肌變白為度，將心臟重置于胸腔，處理好胸腔內(nèi)瘀血、棉球、線頭等外源性污物，用3號線快速逐層縫合第3肋間、肌層及皮膚，待動物呼吸狀態(tài)平穩(wěn)后停小動物呼吸機，斷開經(jīng)喉氣管插管針與小動物呼吸機連接處，恢復(fù)胸腔負壓，待動物能夠自主呼吸后，拔出氣管插管針。在大鼠四肢插入電針，連接至心電圖機，心電圖顯示胸導(dǎo)ST-T段抬高為結(jié)扎成功。術(shù)后注射青霉素鈉3×104U，每日1次，持續(xù)3 d，抗感染。常規(guī)喂養(yǎng)5 d后，第2周將飼料減至常規(guī)喂養(yǎng)量的1/2使大鼠饑餓，同時進行每日1次的力竭式游泳（大鼠游泳時間隨狀態(tài)的變差，力竭時間從初始3 h減少為30 min），持續(xù)4周。期間，大鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動度減低，毛色無光澤、脫毛，甚者出現(xiàn)喉間哮鳴音等體征。經(jīng)心臟彩超檢測左室射血分?jǐn)?shù)（EF）≤50%為CHF造模成功，列入下一步實驗對象。由于此期眶內(nèi)采血未成功，故將BNP的組間對照檢測置于后期取材時進行檢測。

1.4分組及給藥其余43只造模成功的大鼠采用隨機數(shù)字表求余法分為模型組（14只）、中藥組（15只）、西藥組（14只）。此時，空白組亦隨機留取15只以盡量控制各組的樣本量保持平衡狀態(tài)?？瞻捉M和模型組分別給予常規(guī)等容積蒸餾水灌胃，每次3 mL，每日1次。用藥組按照人鼠劑量換算公式給藥。中藥組按含生藥9.2 g/（kg·d）的劑量給予益氣活血復(fù)方灌胃，每日1次，西藥組按生藥1.5 mg/（kg·d）的劑量給予賴諾普利灌胃，每日1次，持續(xù)給藥28 d。

1.5取材及檢測方法由于灌胃給藥期間模型組和治療組（中藥組、西藥組）大鼠出現(xiàn)不同程度的死亡，每組大鼠僅剩余10只，因此，在后期的實驗中每組大鼠取10只進行檢測。大鼠持續(xù)給藥28 d后，禁食不禁水12 h，腹腔麻醉大鼠，打開胸腔，取全心，按實驗檢測要求平均分成兩份，于液氮中冷凍后在-80℃下保存待檢。實時熒光定量PCR技術(shù)和蛋白免疫印跡法（Western blot）測定PGC-1α的基因和蛋白表達，比色法測定ATP濃度，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定BNP濃度。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間采用單因素方差分析（one-way AONVA），組間兩兩比較，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1益氣活血復(fù)方對大鼠心肌組織中BNP濃度的影響治療組及模型組中BNP濃度均升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示心力衰竭（以下簡稱心衰）時心肌組織內(nèi)BNP的含量呈升高趨勢。治療組中BNP濃度降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明藥物治療能夠減少BNP的產(chǎn)生。中藥組與西藥組中BNP濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明中、西藥物的療效相當(dāng)。見表1。

2.2益氣活血復(fù)方對CHF大鼠血漿中ATP濃度的影響治療組及模型組中ATP濃度均減低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示心衰時心肌組織中ATP的含量呈降低趨勢。治療組中ATP濃度均升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明藥物治療能夠提高心肌組織中ATP的含量，促進能量的釋放。中藥組與西藥組ATP濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明中、西藥物的療效相當(dāng)。見表1。

表1　各組大鼠血漿中BNP的濃度及ATP的濃度（x±s）

2.3益氣活血復(fù)方對CHF大鼠心肌組織中PGC-1α表達的影響治療組及模型組中PGC-1α mRNA的表達及蛋白表達均降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示心衰時心肌組織內(nèi)PGC-1α的含量呈降低趨勢。治療組中PGC-1α mRNA的表達及蛋白表達均升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明治療組藥物能夠提高心肌組織中PGC-1α的含量，提示藥物治療能夠增加線粒體的生成。中藥組與西藥組PGC-1α mRNA的表達及蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明中、西藥物的療效相當(dāng)。見表2、圖1。

表2　各組大鼠心肌組織中PGC-1α mRNA及蛋白的表達（x±s）

圖1　各組大鼠中PGC-1α蛋白表達

3　討論

3.1PGC-1α、ATP與CHF的關(guān)系心臟是維持人體生命活動的重要器官，也是主要的耗能器官之一，在人體生命活動中扮演著重要角色。研究認(rèn)為，能量代謝障礙是貫穿于心臟從心肌細胞代償性肥大到心衰過程的重要因素之一。ATP是線粒體氧化的產(chǎn)物，作為能量產(chǎn)生的標(biāo)志，可以監(jiān)測組織的耗能狀況，測定機體組織的供能正常與否。PGC-1α是近年來發(fā)現(xiàn)的與線粒體生物發(fā)生有關(guān)的主要協(xié)調(diào)因子之一，它作為調(diào)節(jié)線粒體生成的一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，參與線粒體的生物發(fā)生，對線粒體的生成起著至關(guān)重要的作用［3］。若心肌受損或長期處于高負荷工作狀態(tài)，心臟做功的能量需求增加，會導(dǎo)致一系列代償反應(yīng)，如心肌細胞的代償性肥大、心肌細胞內(nèi)線粒體的不良增生等，直至心衰的發(fā)生。此過程中，心肌將供能不足的信號進行反射，促發(fā)心肌內(nèi)PGC-1α的生物發(fā)生，增加線粒體DNA的表達和復(fù)制，促進ATP的釋放，從而改善心肌能量代謝狀況，減輕或預(yù)防心衰的發(fā)生。

3.2BNP與CHF的關(guān)系BNP廣泛分布在腦、心臟、骨髓等器官組織內(nèi)，以心臟含量最高，主要由心室肌合成分泌，具有利尿、利鈉、擴血管、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）等多種生物效應(yīng)。BNP能夠反映CHF的病情變化狀況，心衰的等級越高，BNP的含量也越高，其預(yù)后較差［4-5］。本實驗通過比較各組BNP的含量，證實心衰時BNP的含量升高，經(jīng)過中藥和西藥治療后，BNP的濃度相對降低，說明中藥和西藥兩種藥物對CHF均有一定的治療作用。

3.3益氣活血復(fù)方對CHF的影響中醫(yī)學(xué)將心衰歸屬于“水腫”、“胸痹”、“懸飲”、“水飲”等范疇，認(rèn)為心衰的發(fā)生為本虛標(biāo)實，最終導(dǎo)致虛實夾雜的病證。雖各家理解的側(cè)重點不同，但都認(rèn)為心衰的發(fā)生與氣虛、血瘀、水停有關(guān)［6-7］。王娟等［8］發(fā)現(xiàn)，在心衰的中醫(yī)證候分型中，多數(shù)證型的組合，均有氣虛血瘀證的發(fā)生。針對以氣虛為本，血瘀、痰濁、水停為標(biāo)的現(xiàn)象，吾師張艷推出具有益氣活血、利水消腫作用的益氣活血復(fù)方［9］。其中，黃芪補氣，太子參氣血雙補，丹參、紅花活血化瘀，益母草活血化瘀兼利水消腫，茯苓、葶藶子利水消腫。諸藥合用，共奏益氣活血、利水消腫、標(biāo)本同治之功［10］。藥理學(xué)認(rèn)為，黃芪能夠增強正性肌力、為細胞提供動能［11］，丹參能夠改善能量代謝和抑制細胞凋亡［12］，太子參、紅花、益母草能夠保護心?。?3-15］，為本方能夠調(diào)節(jié)心肌能量代謝提供了藥理依據(jù)。

本實驗證明：1）通過比較各組中BNP的濃度，證明心衰造模成功，中、西醫(yī)兩種藥物在治療慢性心衰上有療效，并且療效相當(dāng)。2）在模型組中，PGC-1α的表達以及ATP的含量均低于其他3組，說明心衰發(fā)生時存在著影響線粒體生成和ATP供應(yīng)相對不足的能量代謝障礙。3）在中藥組和西藥組中，PGC-1α的表達以及ATP的含量較模型組均升高，說明中西藥物在治療CHF時可以升高PGC-1α的表達，從而增加線粒體的生成，提高了線粒體的產(chǎn)能量，增加了ATP的輸出。4）在中藥組和西藥組之間，PGC-1α的表達以及ATP的含量比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明中藥組治療后的指標(biāo)療效接近于西藥組，能夠達到所期望的治療效果，值得推廣應(yīng)用。

綜上所述，益氣活血復(fù)方可以增加心肌線粒體的有效生成，提高心肌代謝所需能量的產(chǎn)生，從而改善和糾正CHF的發(fā)生［16］，為中醫(yī)藥防治CHF提供客觀、可信的科學(xué)實驗依據(jù)。

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Effects of Yiqi Huoxue prescription on myocardial energy metabolic with CHF rats after myocardial infarction

LIU Xiu-na1，ZHANG Yan2，LI Hai3
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；3.The Second Chinese Medicine Hospital in Shenyang，Shenyang 110101，China）

［Objective］To study the effects of Yiqi Huoxue prescription on chronic heart failure（CHF）rats after myocardial infarction.［Methods］Twenty rats were selected from eighty healthy SD rats as the blank control group，and the rest was used to prepare CHF rat model by coronary artery ligation in combination with exhausted swimming and food reducing.By detecting the heart color doppler ultrasound and observing signs of changes in rats to determine whether building success.The successful molding rats were randomly divided into Chinese medicine group，Western medicine group and model group，blank control group（n=15）and model group（n=14）were given conventional volume distilled water by intragastric administration，1 time a day，the Chinese medicine group（n=15）was given 9.2 g/（kg·d）crude drugs dose of Yiqi Huoxue prescription every day by intragastric administration，Western medicine group（n=14）was given 1.5 mg/（kg·d）crude drugs dose of Lisinopril every day by intragastric administration.After continuous administration of 28 days，fast and only drink water for 12 hours，getting myocardial tissue and plasma.The concentration of BNP was detected by ELISA，and the concentration of ATP was detected by colorimetric method，using Real-time fluorescent quantitative PCR and immune protein imprinting method to detect PGC-1α gene and protein expression.［Results］Compared with the blank control group，the mRNA expression and the protein expression of PGC-1α and the concentration of ATP were decreased，while the concentration of BNP was increased in model，Chinese medicine and Western medicine group，showing statistical difference（P＜0.05）.Compared with the model group，the mRNA expression and the protein expression of PGC-1α and the concentration of ATP were decreased，while the concentration of BNP was increased in Chinese medicine and Western medicine group，showing statistical difference（P＜0.05）.Compared Chinese medicine group with the Western medicine group，the mRNA expression and the protein expression of PGC-1α and the concentration of ATP and the concentration of BNP had no obvious difference，showing there was no statistically significant difference between the groups（P＞0.05）.［Conclusion］Yiqi Huoxue prescription can activate the PGC-1α factor which is related to myocardial energy metabolism，increase the capacity of mitochondria，in order to improve and correct heart failure.

Yiqi Huoxue prescription；chronic heart failure；PGC-1α；ATP；BNP

R285.5

A

1673－9043（2015）01－0023-04

沈陽市科技創(chuàng)新專項資金項目（F13-316-1-10）。

劉秀娜（1987-），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥干預(yù)慢性心力衰竭機制及療效的研究。

張艷，E-mail：yanzhang1016@126.com。

（2014-09-20）