丹紅、丹參和紅花3種注射液抗氧化活性比較研究*

李　晉，胡　月，葛愛華，白　洋，劉　姣，常艷旭（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

丹紅、丹參和紅花3種注射液抗氧化活性比較研究*

李晉，胡月，葛愛華，白洋，劉姣，常艷旭
（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

［目的］對(duì)丹紅、丹參、紅花注射液的抗氧化活性進(jìn)行比較，研究丹紅、丹參、紅花注射液抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)。［方法］采用清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、鐵離子還原、亞鐵離子螯合實(shí)驗(yàn)測(cè)定3種注射液的抗氧化活性；用高效液相色譜法對(duì)丹參和丹紅注射液中主要的抗氧化活性成分進(jìn)行含量測(cè)定。［結(jié)果］丹紅、丹參、紅花注射液均具有DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力、亞鐵離子螯合能力。［結(jié)論］丹紅、丹參、紅花注射液均具有良好的抗氧化活性，其物質(zhì)基礎(chǔ)與其總酚酸和總黃酮的含量密切相關(guān)。

丹紅注射液；丹參注射液；紅花注射液；抗氧化活性

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.01.10

自由基是人體內(nèi)參與正常代謝的物質(zhì)，但當(dāng)其超過機(jī)體的清除能力時(shí)便攻擊細(xì)胞內(nèi)的包括DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、有機(jī)酸等幾乎所有的生物分子，具有很強(qiáng)的破壞性［1］，實(shí)驗(yàn)表明自由基與許多心血管疾病的發(fā)生都密切相關(guān)［2］。適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充抗氧化劑能有效的促使機(jī)體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)恢復(fù)到正常的水平，但人工合成的抗氧化劑存在或多或少的潛在毒性，因而從天然產(chǎn)物中尋找抗氧化劑成為治療心血管疾病的一種趨勢(shì)［3］。

丹紅注射液是由中藥丹參、紅花經(jīng)過提取等制成的復(fù)方制劑，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死等心腦血管疾病［4-6］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參注射液具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量等作用，被廣泛用于臨床各種心血管疾病的治療［7］。紅花注射液，具有活血通經(jīng)，散癖止痛的功效，用于治療血脈閉塞、冠心病、高血壓和心絞痛等［8］。

現(xiàn)代研究表明，丹紅、丹參、紅花3種注射液均具有抗氧化活性［9-11］，均可以治療心腦血管疾病。但是有關(guān)丹紅、丹參、紅花3種注射液的抗氧化活性比較，以及抗氧化活性與有效成分之間的關(guān)聯(lián)的報(bào)道相對(duì)來說較少。因此，通過1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）清除自由基能力、對(duì)鐵離子的還原能力、亞鐵離子螯合能力的測(cè)定，比較3種注射液的抗氧化活性大小，并測(cè)定其中總酚酸和總黃酮的含量。結(jié)果表明總酚酸和總黃酮的含量與抗氧化活性大小一致，為其臨床應(yīng)用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀，包括在線真空脫氣機(jī)、高壓四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）（美國(guó)Agilent公司）。Tecan Infinite M200 Microplate Reader多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan集團(tuán)公司），Costar-3599 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Costar公司），F(xiàn)lexStation 3多功能孔板分析儀（美國(guó)MolecuLar Devices公司），XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西儀器廠有限公司）等。

1.2試藥

1.2.1試劑抗壞血酸［維生素C（VC）分析純，天津市北方化玻購(gòu)銷中心］，生育酚［維生素E（VE）分析純，天津市北方化玻購(gòu)銷中心］，亞硝酸鈉（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純），三氯化鐵（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純），DPPH（美國(guó)Sigmaaldrich公司），硫酸亞鐵（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純），鐵氰化鉀（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純），磷酸氫二鈉（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純），磷酸二氫鈉（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純），F(xiàn)errozine（BR-生物試劑-Biogical reagent，1g進(jìn)口），三氯乙酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），雙氧水（30%），無水碳酸鈉（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純），甲酸（Tedia）水為超純水（Milli-Q），乙腈（美國(guó)Fisher），甲酸（高純，含量＞99.99%，美國(guó)Tedia天地試劑公司），其余試劑均為色譜純。

1.2.2藥材沒食子酸，蘆丁，丹參素，原兒茶酸，原兒茶醛，咖啡酸，迷迭香酸，紫草酸，迷迭香酸，丹酚酸B，丹酚酸A，均購(gòu)自中國(guó)藥品制品檢定所提供且純度均大于98%。紅花注射液、丹參注射液和丹紅注射液購(gòu)買于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院。

2　方法

2.1DPPH自由基清除能力的測(cè)定分別取丹紅、丹參注射液和紅花注射液于eppendorf（EP）管中，用甲醇配成一系列濃度，取450 μL樣品加入450 μL DPPH（100 μg/mL）溶液，混合室溫下放置30 min后，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)下吸光度，以VC和VE作為陽性對(duì)照［12］，每份樣品平行操作3次。清除率計(jì)算公式K=［1-（A1-A）2/A0］×100%，其中A0為空白對(duì)照的吸光度，A1為加入待測(cè)液后的吸光度，A2為待測(cè)液的吸光度。

2.23種注射液對(duì)鐵離子還原能力的測(cè)定

2.2.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取沒食子酸（GAE）標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用甲醇配成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）和鐵氰化鉀（1%，質(zhì)量體積比：W/V），混勻于50℃下水浴20 min。加入三氯乙酸（10%，質(zhì)量體積百分比：W/V）后，取上清液用水稀釋1倍，加入氯化鐵溶液（0.1%，質(zhì)量體積比：W/V），30 min后在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以甲醇-水代替沒食子酸作為空白溶液，每份樣品平行操作3次。以沒食子酸的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.003 7X+ 0.068 8（r2=0.997）。

2.2.2GAE當(dāng)量的計(jì)算分別取3種注射液，甲醇稀釋50倍于EP管中，按照“2.2.1”項(xiàng)操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用回歸方程求出供試品溶液中折合沒食子酸的濃度，即GAE當(dāng)量。

空白組：超純水代替氯化鐵溶液（0.1%，質(zhì)量體積比：W/V）。

2.33種注射液亞鐵離子螯合能力的測(cè)定分別取3種注射液1mL，分別加入1mL硫酸亞鐵（FeSO）4，0.025 mmol/L，再加入1 mL Ferrozine（0.025 mmol/L），10 min后562 nm下測(cè)定其吸光度，以甲醇-水溶液代替樣品作為對(duì)照，每份樣品平行操作3次。螯合率計(jì)算公式：（1-A）1/A0×100%，其中A1為樣品吸光度，A0為空白樣品對(duì)照吸光度。

2.4福林試劑法測(cè)定總酚酸含量

2.4.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取不同體積的沒食子酸（1.0 g/L）對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋成8個(gè)濃度，分別加入500 μL福林試劑（1∶10，體積比：V/V），混勻后加入400 μL的碳酸鈉（Na2CO3，7.5%，質(zhì)量體積比：W/V），30℃反應(yīng)90 min，于微型多功能酶標(biāo)儀765 nm下測(cè)定，以待測(cè)液的本底溶液為空白對(duì)照［13］，每份樣品重復(fù)3次。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y =0.005 1X+ 0.106 6（r2=0.999），在1.562 5～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2樣品總酚酸含量測(cè)定分別取3種供試品溶液100 μL，按照“2.4.1”項(xiàng)操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用回歸方程求出供試品溶液中折合沒食子酸的濃度（總酚酸），并計(jì)算3種注射液中總酚酸的含量。

2.5三氯化鋁比色法測(cè)定總黃酮含量

2.5.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密吸取不同體積的蘆丁對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成不同的濃度。分別取1 mL于EP管中，加入100 μL的亞硝酸鈉（NaNO2，5%），靜置6 min后加入100 μL的三氯化鋁（AlCl3，10%），靜置6 min后加入1 mL的氫氧化鈉（NaOH，5%），混合均勻，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以待測(cè)液的本底溶液為空白對(duì)照［14］，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y =0.006 0X+0.075 0（r2=0.998 8），結(jié)果表明在1～500 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2樣品總黃酮含量測(cè)定分別取3種供試品溶液（稀釋10倍）各1 mL，按照“2.5.1”項(xiàng)操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用回歸方程求出供試品溶液中折合蘆丁的濃度（總黃酮），并計(jì)算總黃酮的含量。

2.6丹參和丹紅注射液中活性成分的含量測(cè)定

2.6.1液相色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%甲酸水（B）；流速：300 μL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。梯度洗脫程序，見表1。

表1　梯度程序洗脫表

2.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取適量的丹參素（1.0 g/L），原兒茶醛（1.02 g/L），咖啡酸（1.01 g/L），迷迭香酸（1.01 g/L），紫草酸（1.0 g/L），丹酚酸B（1.01 g/mL），丹酚酸A（0.99 g/mL）等溶液，制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6.3含量測(cè)定進(jìn)樣丹參和丹紅注射液5 μL，計(jì)算各個(gè)化合物的含量。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS19.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。

3　結(jié)果

3.1丹紅、丹參、紅花3種注射液抗氧化活性比較

3.1.1丹紅、丹參、紅花3種注射液的清除DPPH自由基能力比較采用DPPH法，以IC50值為指標(biāo)，測(cè)定丹紅、丹參、紅花3種注射液的抗氧化活性，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，紅花、丹參、紅花3種注射液均具有較好的抗氧化活性，其中以丹參的抗氧化活性為最好，丹紅注射液介于丹參與紅花之間，但其抗氧化能力均小于VC和VE。

表2　3種注射液DPPH清除率及VC、VE對(duì)照（x±s）μg/mL

3.1.2丹紅、紅花、丹參3種注射液對(duì)鐵離子的還原能力測(cè)定考察了3種注射液對(duì)鐵離子的還原能力，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，丹紅、丹參及紅花注射液均具有良好的鐵離子還原能力，其還原能力測(cè)定順序?yàn)榈⒆⑸湟?、紅花注射液、丹紅注射液。

3.1.3丹紅、紅花、丹參3種注射液的亞鐵離子螯合能力測(cè)定考察了3種注射液對(duì)亞鐵離子螯合能力的測(cè)定，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，丹紅、紅花、丹參3種注射液的鐵離子螯合能力均不是很強(qiáng)，清除率均小于25%。順序如下：丹紅注射液＞丹參注射液＞紅花注射液。

表3　3種注射液的沒食子酸當(dāng)量（x±s）μg/mL

圖1　3種注射液亞鐵離子螯合能力測(cè)定

3.1.4總酚酸及總黃酮含量測(cè)定本研究中采用福林試劑法，對(duì)丹紅、丹參、紅花3種注射液的總酚酸含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，總酚酸含量從高到低的順序?yàn)榈⒆⑸湟?、丹紅注射液、紅花注射液，該結(jié)果與清除DPPH自由基能力一致。

本實(shí)驗(yàn)研究采用了三氧化鋁比色法測(cè)定丹紅、丹參、紅花3種注射液中總黃酮的含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，總黃酮含量從高到低的順序?yàn)榈⒆⑸湟?、丹紅注射液、紅花注射液，該結(jié)果與總酚酸的含量測(cè)定和清除DPPH自由基能力均一致。

表4　3種注射液中總酚酸沒食子酸和總黃酮蘆丁當(dāng)量（x±s）μg/mL

3.2丹紅、丹參注射液中主要化合物含量測(cè)定本實(shí)驗(yàn)研究通過運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)丹參、丹紅注射液中主要的7種抗氧化活性成分進(jìn)行了含量測(cè)定，其分離效果圖見圖2，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表5，含量測(cè)定結(jié)果見表6。結(jié)果表明，各個(gè)化合物分離效果良好；各線性方程r2均大于0.999，表明其線性關(guān)系良好；抗氧化活性成分含量均較高，為其發(fā)揮抗氧化能力提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

4　討論

許多研究表明氧化損傷與心血管病密切相關(guān)。環(huán)境及膳食中某些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后通過體內(nèi)的代謝過程，引起活性氧自由基大量生成、內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)減少甚至耗竭，從而引發(fā)脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子的一系列改變，進(jìn)而引起心血管疾?。?5-18］。近年研究證實(shí)，抗氧化劑無論在體內(nèi)還是在體外實(shí)驗(yàn)均有很強(qiáng)的清除自由基作用，在心血管病的發(fā)生中均具有重要的生理及藥理作用［19］?；瘜W(xué)合成的抗氧化劑一般都存在一定的不良反應(yīng)，因而從天然產(chǎn)物中尋找抗氧化劑仍然是一個(gè)熱點(diǎn)話題［20］。

圖2　典型高效液相色譜圖

表5　各標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程

表6　丹紅、丹參注射液含量測(cè)定結(jié)果μg/mL

在本研究中，丹參、紅花及丹紅注射液可通過直接清除DPPH自由基、還原鐵離子、亞鐵離子螯合能力而發(fā)揮抗氧化能力，其中丹參的抗氧化活性最好，三者均可以用來治療心血管疾病。3種注射液抗氧化活性的有效成分是酚酸類和黃酮類成分，并且總酚酸和總黃酮的含量與抗氧化活性能力一致。對(duì)丹參及丹紅注射液中有效成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，為抗氧化活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Comparison of antioxidant activities of Danhong，Danshen and Honghua injection

LI Jin，HU Yue，GE Ai-hua，BAI Yang，LIU Jiao，CHANG Yan-xu
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To compare the antioxidant activity of Danhong，Danshen and Honghua injection and investigate the material basis for the antioxidant activity.［Methods］DPPH free radical scavenging，ferric reducing ability，ferrous ion chelating ability experiments were used for evaluation of the antioxidant components of Danhong，Danshen and Honghua injection.The main antioxidant components in Salvia and Danhong injection were determined by HPLC.［Results］Danhong，Danshen and Honghua injection had the DPPH free radical scavenging，ferric reducing ability，ferrous ion chelating ability.［Conclusion］The results suggest that Danhong，Danshen and Honghua injection have good antioxidant activity，which is closely related to the material basis of their total phenolic content of total flavonoids.

Danhong injection；Danshen injection；Honghua injection；antioxidant

R285.5

A

1673－9043（2015）01－0037-05

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（12JCQ NJC08800）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃（TD12-5033）資助。

李晉（1981-），女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥藥理研究。

常艷旭，E-mail：tcmcyx@126.com。

（2014-10-28）