固腸膠囊對慢性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥介質(zhì)及結(jié)腸黏膜的影響

孫曉萍，唐　方（.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津30700；.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院中醫(yī)科，天津30005）

固腸膠囊對慢性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥介質(zhì)及結(jié)腸黏膜的影響

孫曉萍1，唐方2
（1.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津301700；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院中醫(yī)科，天津300052）

［目的］觀察固腸膠囊對慢性潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-10（IL-10）水平及結(jié)腸病理組織的影響，探討其可能作用機制。［方法］Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、固腸膠囊高、中、低劑量組，采用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液及葡聚糖硫酸鈉（DSS）聯(lián)合應(yīng)用復(fù)制大鼠慢性UC模型，于造模緩解復(fù)發(fā)期灌胃給藥10 d，觀察各組大鼠疾病活動指數(shù)（DAI），結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）及病理組織學改變，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清TNF-α、IL-10水平。［結(jié)果］與空白對照組比較，模型組DAI、CMDI評分及血清TNF-α水平顯著升高（P＜0.01），IL-10水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，固腸膠囊能明顯升高血清IL-10水平（P＜0.05），降低DAI、CMDI評分（P＜0.01）及血清TNF-α水平（P＜0.05），促進潰瘍修復(fù)。［結(jié)論］固腸膠囊可通過抑制血清TNF-α表達、促進血清IL-10表達，抑制炎癥進展，減輕結(jié)腸組織因過度免疫介導(dǎo)作用而導(dǎo)致的腸黏膜損傷而治療慢性UC。

慢性潰瘍性結(jié)腸炎；固腸膠囊；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-10

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.01.09

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是以腹瀉、黏液膿血便、腹痛為主要臨床癥狀，以結(jié)腸黏膜慢性炎癥和潰瘍形成為病理特點的非特異性腸病，目前病因不明，常反復(fù)發(fā)作，現(xiàn)代醫(yī)學對本病多采用柳氮磺胺吡啶結(jié)合皮質(zhì)激素進行治療，但療效并不理想［1］，目前應(yīng)用中醫(yī)藥治療UC已成為一種重要的治療手段，其治療效果不斷得到臨床肯定［2-3］，其中固腸膠囊具有散寒清熱、調(diào)和氣血、澀腸止瀉之功用，臨床應(yīng)用證實其治療UC療效顯著，既往藥效學研究證實該藥具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制平滑肌收縮等作用，對慢性實驗性結(jié)腸炎有促愈合作用，但其作用機制尚不明確，為進一步認識固腸膠囊治療慢性UC的作用機制，筆者在成功復(fù)制慢性UC動物模型的基礎(chǔ)上，觀察了固腸膠囊對慢性UC大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）及結(jié)腸病理組織學改變的影響。

1　材料

1.1動物SPF級雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所提供（合格證號：SCXK京2009-0004）。

1.2藥物與試劑固腸膠囊由黃連、黃柏、訶子、肉豆蔻、厚樸、吳茱萸、建曲、肉桂、干姜、花椒、川芎、五倍子、牡蠣、烏梅組成，由天津中新藥業(yè)集團股份有限公司提供（批號J002）。

5%2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號068k5001，美國Sigma公司），葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子量5 000，批號STF2213 REF BMS622，日本光和純藥株式會社），無水乙醇（天津江天化工技術(shù)公司），便潛血（OB）試劑［批號070815，（臺資）珠海貝索生物技術(shù)有限公司］，大鼠TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒（批號65593028，65854010，Ebioscience）。

1.3儀器D-37520型低溫離心機（德國），A-5082型酶標定量測定儀。

2　動物分組

40只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組、模型組、固腸膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組8只。

3　方法

3.1模型制備除空白對照組外，根據(jù)文獻報道［4-6］，將TNBS與DSS聯(lián)合應(yīng)用進行造模：1）5%TNBS與50%無水乙醇以體積1∶1配成TNBS/乙醇混合液；

DSS用蒸餾水配成5%DSS水溶液。2）各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，禁食不禁水24 h，稱質(zhì)量，采用10%水合氯醛（0.03 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將8號導(dǎo)尿管輕輕插入肛門上端8 cm，按0.04 mL/kg（相當于TNBS劑量100 mg/kg），用1 mL注射器緩慢注入相應(yīng)體質(zhì)量比例TNBS/乙醇混合液，空白對照組注入相應(yīng)體質(zhì)量比例生理鹽水，再注入0.5 mL空氣，倒立5 min，仰臥歸籠，自然蘇醒與飲食。實驗第10天后，以大鼠大便潛血“+”為標準，模擬慢性UC的緩解復(fù)發(fā)病程，給造模組大鼠5%DSS水溶液代替飲水自由飲用，每次24 h，空白對照組大鼠則飲用生理鹽水，實驗期間共復(fù)發(fā)2次。

3.2給藥方法及標本采集各組大鼠自第1次復(fù)發(fā)時開始灌胃給藥，給藥劑量分別為固腸膠囊高劑量組1 500 mg/kg、中劑量組1 125 mg/kg、低劑量組750 mg/kg組，各組等效劑量相當于60 kg體質(zhì)量成人每日臨床用量的20、15、10倍?？瞻讓φ战M和模型組大鼠灌胃1 mL生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥10 d。各組動物最后1次灌胃后，禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉全部殺檢，腹主動脈采血，靜置后3 000 r/min離心10 min分離血清，-20℃冰箱保存待測。剖取大鼠肛門至盲腸末端的結(jié)腸段，清理腸系膜及粘連組織，沿腸系膜縱軸剪開，冰生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，平鋪于濾紙上，記錄結(jié)腸黏膜損傷情況待評分。取大鼠結(jié)腸病變最明顯處組織一小部分，用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色進行病理組織學觀察。

3.3DAI、CMDI評分，血清TNF-α、IL-10水平的測定觀察記錄大鼠精神狀態(tài)、活動、皮毛色澤、體質(zhì)量、大便性狀及便隱血狀況，按表1進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分［7-8］；參照文獻［9-10］，按表2進行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分。血清TNF-α、IL-10的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

表1　DAI評分表分

3.4統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）進行描述，正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD檢驗，若方差不齊采用Dunnett’s T3法；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表2　CMDI評分表分

4　結(jié)果

4.1固腸膠囊對慢性UC模型大鼠DAI、CMDI的影響見表3。與空白對照組比較，模型大鼠DAI及CMDI評分均明顯升高，但與模型組比較，固腸膠囊高、中劑量組DAI及CMDI評分顯著降低。

表3　固腸膠囊對慢性UC模型大鼠DAI、CMDI的影響（x±s）分

4.2血清TNF-α、IL-10水平的影響見表4。與空白對照組相比，模型組血清TNF-α水平顯著升高、IL-10水平顯著降低，與模型組相比，固腸膠囊高劑量能顯著降低血清TNF-α水平，中、低劑量有一定作用，但差異無統(tǒng)計學意義，固腸膠囊高、中劑量組與模型組相比血清IL-10水平顯著升高。

表4　固腸膠囊對慢性UC模型大鼠TNF-α、IL-10的影響（±s）pg/mL

表4　固腸膠囊對慢性UC模型大鼠TNF-α、IL-10的影響（±s）pg/mL

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

?

4.3固腸膠囊對慢性UC模型大鼠結(jié)腸組織病理學觀察見圖1。空白對照組結(jié)腸黏膜完整，腺體排列整齊，無潰瘍及炎細胞浸潤。模型組黏膜出現(xiàn)不同程度缺損和壞死脫落，潰瘍形成，腺體缺失，杯細胞減少，廣泛炎細胞浸潤，纖維組織增生。固腸膠囊高劑量組黏膜基本修復(fù)或以瘢痕為主，可見新生黏膜和/或腺體增生，杯細胞增多，炎癥減輕，纖維組織增生，呈修復(fù)改變。固腸膠囊中劑量組可見局限性潰瘍或以瘢痕為主，潰瘍基底部被纖維組織填充，潰瘍邊緣腺體增生，炎細胞浸潤減輕，杯細胞增多，呈修復(fù)改變。固腸膠囊低劑量組黏膜仍見不同程度缺失，可見炎性細胞浸潤，杯細胞減少，纖維組織增生。

圖1　各組大鼠結(jié)腸組織病理學觀察（HE染色×100）

5　討論

目前已證實免疫因素與UC的病因和發(fā)病機制密切相關(guān)，其中細胞因子在UC發(fā)生發(fā)展中的作用已得到公認［11］，促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間平衡失調(diào)被認為是UC的重要發(fā)病機制之一，促炎與抗炎細胞因子的免疫平衡被破壞，即導(dǎo)致腸道黏膜受到過強的炎癥刺激，引起腸道損傷。與UC關(guān)系密切的促炎因子主要有IL-1、IL-6等，抑炎因子主要有IL-4、IL-10等，其中以炎性因子TNF-α，IL-10等較具代表性，因此選取此兩項指標進行觀察，以探討固腸膠囊對慢性UC治療作用的可能機制。

一般情況，模型大鼠在造模后普遍出現(xiàn)蜷臥少動，被毛松散，肉眼血便或黏液稀便、體質(zhì)量下降等癥狀，DAI評分顯著升高，經(jīng)治療后，固腸膠囊高、中劑量組DAI評分顯著降低，肉眼觀察高、中劑量組結(jié)腸大體形態(tài)較模型組潰瘍數(shù)量減少、面積減小，黏膜充血水腫減輕。治療后各組病理組織學改變亦可見差異性。

腸道細胞自身分泌和腸道黏膜淋巴細胞分泌的TNF-α作用于臨近腸道細胞，調(diào)節(jié)腸道細胞增殖和凋亡，對維持腸道細胞數(shù)量和功能的動態(tài)平衡起重要作用［12］。病理情況下，腸道黏膜中多種炎性細胞均可大量分泌TNF-α［13］，既可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞大量凋亡，同時作為炎癥介質(zhì)參與黏膜固有層炎性反應(yīng)和上皮細胞壞死脫落，造成結(jié)腸黏膜水腫和潰瘍。IL-10能有效抑制活化的單核細胞和巨噬細胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎細胞因子，參與維持腸道細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡［14］；敲除小鼠IL-10基因能導(dǎo)致實驗性結(jié)腸炎［15］，而應(yīng)用IL-10灌腸治療UC患者，能明顯改善腸道黏膜炎性反應(yīng)［16-18］，說明IL-10參與UC發(fā)病，在維持正常腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠血清IL-10水平明顯降低（P＜0.01）、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01），而固腸膠囊高、中劑量組較模型組血清IL-10水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），與空白對照組水平接近；固腸膠囊高劑量組能顯著降低大鼠血清TNF-α水平（P＜0.01），中、低劑量組能一定程度降低大鼠血清TNF-α水平。說明固腸膠囊可通過升高血清IL-10，抑制TNF-α等促炎細胞因子的表達，改善腸道黏膜的過度炎癥反應(yīng)，抑制炎性介質(zhì)過度釋放和免疫介導(dǎo)作用而導(dǎo)致的腸黏膜損傷、黏膜充血水腫和炎細胞浸潤，促進結(jié)腸黏膜修復(fù)與潰瘍愈合。

綜上研究結(jié)果，提示固腸膠囊可通過提高某些抗炎細胞因子水平、降低某些促炎細胞因子水平發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫平衡作用，降低腸道過度免疫反應(yīng)，減輕腸道損傷，促進腸黏膜修復(fù)。從總體治療效果看，其治療作用具有一定劑量依賴效應(yīng)，尤以固腸膠囊高劑量的藥理活性和效果最佳，但是在實驗結(jié)束時固腸膠囊組的黏膜評分及組織病理學改變?nèi)愿哂诳瞻讓φ战M，提示在實驗周期內(nèi)模型大鼠病癥尚未徹底治愈，適當延長治療時間或可獲得更佳療效。

［1］許國銘，李石.現(xiàn)代消化病學［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1999：911，917.

［2］劉萬里，沈洪，單兆偉，等.腸安膠囊對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫機制的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2003，20（6）：58-60.

［3］楊春華.烏梅丸加減治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎47例臨床體會［J］.天津中醫(yī)藥，2008，25（3）：235-236，

［4］Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model ofchronic inflammation and ulceration in the rat colon［J］. Gastroenterology，1989，96（3）：795.

［5］Osman N，Adawi D，Ahrne S，et al.Modulation of the effect of dextran sulfate sodium-induced acute colitis by the administration of different probiotic strains of Lactobacillus and Bifidobacterium［J］．Dig Dis Sci，2004，49（2）：320.

［6］孫曉萍，侯麗娟，王曉紅，等.大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立及操作規(guī)范探討［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2012，29（3）：270-274.

［7］Steidler L，Hans W，Schotte L，et al.Treatmentofmurine colitis by lactococcus lactis secreting interleukin-10［J］. Science，2000，289：1352.

［8］陳遲，冉志華，蕭樹東，等.普伐他汀對乙酸誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎的治療作用及其機制的研究［J］.中華醫(yī)學雜志，2006，86（18）：1284-1285.

［9］Butzner JD，Parmar R，Bell CJ，et al.Butyrate enema therapy stimulates mucsal repair in experimental colitis in the rat［J］. Gut，1996，38（4）：568-570.

［10］王皓，歐陽欽，胡仁偉.三硝基苯磺酸結(jié)腸炎動物模型建立［J］.胃腸病學，2001，6（1）：7.

［11］Schreiber S，Raedler A，Stenson WF，et al.Changes in chemical coding of myenteric neurones in ulcerative colitis［J］. Gastroenterol Clin North Am，1992，21：451-502.

［12］Ruemmele FM，Seidman EG.Cytokine-intestinal epithelial cell interactions：implications for immune mediated bowel disorders［J］.Acta Paediatr Sin，1998，39：1.

［13］Van Deventer SJ.Tumour necrosis factor and Crohn’s disease［J］.Gut，1997，40：443-445.

［14］Norman J.The rolecy to kines in the pathogenesis of acute pan-creastitis［J］.Am J Surg，1998，175：76-77.

［15］Rennick DM，F(xiàn)ort MM.Association of IL-10 and TNF-alpha genotypes with ANCA appearance in ulcerative colitis［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2000，278（6）：G829-830.

［16］Wichan P，Chojnacki J，Wojtun S.Immunotherapy of inflammatory bowel disease［J］.Pol Merkur Lekarski，2004，17（1）：70-73.

［17］張鳳林.中藥內(nèi)服聯(lián)合灌腸治療慢性結(jié)腸炎39例［J］.天津中醫(yī)藥，2005，22（3）：214.

［18］于洪.針灸與中藥并用治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床觀察［J］.天津中醫(yī)藥，2008，25（2）：167.

Effects of Guchang capsules on expression of inflammatory mediators and colonic mucosa in ulcerative colitis rats

SUN Xiao-ping1，TANG Fang2
（1.Tianjin Wuqing Chinese Medicine Hospital，Tianjin 301700，China；2.Traditional Chinese Medicine Department，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China）

［Objective］To observe the effects of Guchang capsules on expression of expression of inflammatory mediators and intestinal mucosa in chronic ulcerative colitis（UC）rats，and explore its mechanism.［Methods］Wistar rats was randomly divided normal group，model group，Guchang cupsules high dose，middle dose and low dose group，2，4，6 trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS）/ethanol solution and dextran sulfate sodium（DSS）was administrated to make chronic ulcerative colitis rats models.Rats were treatmented for 10 days，then，ats'disease activity index（DAI），colonic mucosal damage index（CMDI）and the histological changes were assessed．Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）methods was used to determine the expression of TNF-α and IL-10 in blood serum.［Results］Compared with normal group，DAI and CMDI sores，and TNF-α content of model group were significantly increased（P＜0.01）.IL-10 contentas significantly decreased（P＜0.01）.Compared with model group，Guchang capsules could significantly increase IL-10 content（P＜0.05），decrease DAI scores，CMDI sores（P＜0.01）and TNF-α content（P＜0.05），and promote the restoration of the facilitate ulcer.［Conclusion］By increasing IL-10 expression and decreasing TNF-α expression，Guchang capsules can limit inflammation progress and ruduce colonic mucosal damage induced by exceesive immune mediated role to treat UC consequently.

chronic ulcerative colitis；Guchang capsules；TNF-α；IL-10

R285.5

A

1673-9043（2015）01-0030-04

孫曉萍（1986-），女，碩士，從事中藥藥理及消化系統(tǒng)疾病研究。

唐方，E-mail：zhongyi3599@sina.com。

（2014-11-10）