秸稈生物酶法制備可發(fā)酵葡萄糖和木糖的分析研究

慈元釗，付玲弟，周凱旋

（山東尤特爾生物科技有限公司，山東濟(jì)寧 273500）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)業(yè)秸稈每年的產(chǎn)量約為8億噸，大量的農(nóng)業(yè)秸稈基本都沒(méi)有得到有效的利用，焚燒、隨意丟棄是主要的處理方式，帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。[1-3]

秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素、木素。纖維素是由數(shù)以萬(wàn)計(jì)葡萄糖分子聚合而成，半纖維素是由戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖，為異質(zhì)多糖。[4]纖維素、半纖維素均可通過(guò)降解產(chǎn)生單糖分子，產(chǎn)生的單糖可進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、L-乳酸等。

大部分的實(shí)驗(yàn)研究都對(duì)秸稈粉末進(jìn)行了化學(xué)或物理方法預(yù)處理?；瘜W(xué)方法主要是由稀酸、稀堿、氨水等浸泡。利用稀酸預(yù)處理容易造成設(shè)備的腐蝕，水解液中產(chǎn)生糠醛、呋喃等物質(zhì)；堿法處理的預(yù)水解液中有大量的木素等物質(zhì)溶出，后續(xù)預(yù)水解液處理麻煩。物理方法主要通過(guò)對(duì)秸稈粉末進(jìn)行微波、蒸汽爆破等，需要消耗大量的能量，與我國(guó)節(jié)能減排的大方向不一致。還有一些進(jìn)行物理化學(xué)相結(jié)合的方式，雖然木質(zhì)纖維素的水解率有了大幅度的提升，但實(shí)際運(yùn)用起來(lái)困難重重并不現(xiàn)實(shí)。

王安東等研究了秸稈雙酶糖化，但秸稈糖化率較低，也不適合推廣。[5]本研究使用尤特爾生產(chǎn)的纖維素酶、木聚糖酶進(jìn)行處理秸稈粉末，分析不同酶用量以及反應(yīng)時(shí)間下的水解率，為利用秸稈進(jìn)行生產(chǎn)L-乳酸做好理論基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米秸稈購(gòu)自山東鄒城農(nóng)村，粉碎至1mm左右，置于干燥處備用；纖維素酶、木聚糖酶為山東尤特爾生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SP-56型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，DIOONEX-5000離子色譜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶活測(cè)定

纖維素酶測(cè)定參照中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2583-2003，木聚糖酶測(cè)定參照QB/T4483-2013。

1.3.2 酶活pH、溫度曲線(xiàn)測(cè)定

測(cè)定纖維素酶、木聚糖酶酶活的pH、溫度曲線(xiàn)，選擇最優(yōu)的處理?xiàng)l件。

1.3.3 酶解反應(yīng)條件

按1:10的料液比添加最適酶活的pH緩沖液，然后分別加入相應(yīng)用量的纖維素酶、木聚糖酶混勻，放入已升溫至最佳酶活條件下的電熱恒溫水浴振蕩鍋中分別反應(yīng)0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h后取出，振蕩速度為150r/min。放入沸水浴中煮沸10 min，冷卻，離心。離心得到的殘?jiān)偌尤ルx子水洗滌3遍，每遍加水25ml，每次洗滌后離心取上清液，將所有的上清液混合一起測(cè)量體積，并測(cè)定還原糖濃度，比較不同酶用量以及處理時(shí)間下對(duì)秸稈的降解效果，以酶解時(shí)間為0h的為對(duì)照組。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分析方法

秸稈組成成分分析。測(cè)定處理前的秸稈中水分、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的組分，分析方法參照《制漿造紙分析與檢測(cè)》中的測(cè)試方法[6]。

還原糖測(cè)定。酶降解秸稈產(chǎn)生的單糖采用離子色譜進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 酶活測(cè)定

經(jīng)測(cè)定計(jì)算，本次實(shí)驗(yàn)所用的纖維素酶酶活（CMC）在酸性條件下為3500IU/mL；木聚糖酶酶活在中性條件下為98120IU/mL。

2.2 酶活變化曲線(xiàn)的繪制

測(cè)定了纖維素酶、木聚糖酶在pH4.0-9.0，溫度30-80℃下的酶活。酶活保留率曲線(xiàn)如圖1。

從酶活保留率曲線(xiàn)來(lái)看，纖維素酶在pH5.5，溫度60℃條件下有最大的酶活，pH在5.0-6.0，溫度在50-80℃范圍內(nèi)，酶活保留率均在60%以上。木聚糖酶在pH6.5，溫度50℃條件下有最大的酶活，pH在5.5-7.0，溫度在40-60℃范圍內(nèi)，酶活均保留在80%以上。說(shuō)明尤特爾纖維素酶、木聚糖酶的適用范圍較為廣泛。

2.3 秸稈組分分析結(jié)果

秸稈組成成分為纖維素37.43%；半纖維素23.18%；木質(zhì)素21.03%；水分10.2% 。

2.4 秸稈酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 纖維素酶酶用量對(duì)秸稈水解的影響

稱(chēng)取3g（絕干）秸稈粉，以固液比1:10的比例添加pH5.5緩沖液，根據(jù)纖維素酶的最適反應(yīng)條件置于60℃恒溫振蕩水浴鍋中預(yù)熱十分鐘，振蕩速度為150r/min。然后以50IU/g（絕干）、100IU/g、150IU/g、200IU/g、250IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g 加 入纖維素酶稀釋液。在此條件下，反應(yīng)48h取出，測(cè)定葡萄糖含量，計(jì)算水解率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

秸稈的水解率隨纖維素酶用量的增加逐漸增加，但用量超過(guò)300IU/g時(shí)，水解率提升并不顯著，從使用成本考慮，酶用量選擇300IU/g。由于纖維素酶的作用位點(diǎn)是固定的，隨著用量的增加，發(fā)生反應(yīng)的位點(diǎn)增加，但是酶用量大于作用位點(diǎn)時(shí)，水解率便不再大幅度提高。

2.4.2 纖維素酶處理時(shí)間對(duì)秸稈水解的影響

實(shí)驗(yàn)方法參照2.3.1。纖維素酶添加量為300IU/g。在此條件下，每隔12小時(shí)取出一個(gè)樣品沸水浴滅活10min。測(cè)定水解率，結(jié)果如圖3。

隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，水解率逐漸提升，反應(yīng)48h以后，水解率提升幅度越來(lái)越小。為了節(jié)約成本可將水解時(shí)間調(diào)整為48h。纖維素酶的處理時(shí)間越長(zhǎng)，秸稈中的纖維素含量越低，水解率增加幅度也逐漸降低。

2.4.3 木聚糖酶酶用量對(duì)秸稈水解率的影響

實(shí)驗(yàn)方法參照2.3.1，緩沖液使用pH6.5的緩沖液，反應(yīng)溫度50℃，酶用量分別為100IU/g（絕干）、200IU/g、300IU/g、400IU/g、500IU/g、600IU/g、700IU/g、800IU/g。反應(yīng)時(shí)間48h，反應(yīng)完畢測(cè)定水解率。結(jié)果如圖2所示。

木聚糖酶處理后的秸稈水解率相對(duì)纖維素酶處理的較低，木聚糖酶用量在500IU/g以上時(shí)，水解率提升速率較低，因此用量選擇500IU/g。木聚糖酶主要降解秸稈中的半纖維素組分，因?yàn)榻斩捴邪肜w維素與纖維素、木質(zhì)素相互交纏，半纖維素含量又相對(duì)較低，因此其水解率明顯低于纖維素的水解率。

2.4.4 木聚糖酶酶處理時(shí)間對(duì)秸稈水解的影響

實(shí)驗(yàn)方法與條件參照2.3.3，酶用量選擇500IU/g，每隔12h取出一個(gè)樣品沸水浴滅活10min。測(cè)定水解率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，半纖維素的水解率逐漸增高，48h以后水解率提升幅度較低，因此最佳處理時(shí)間選擇48h。

圖2 不同酶用量下的水解率

圖3 不同處理時(shí)間下的水解率

2.5 混合酶處理秸稈

根據(jù)各單因素實(shí)驗(yàn)，確定纖維素酶、木聚糖酶的用量分別為300IU/g、500IU/g。綜合兩種酶在不同pH以及溫度下的酶活保持率，最終選擇反應(yīng)條件pH5.5，溫度50℃。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)每隔12h取出一個(gè)樣品測(cè)定水解率，結(jié)果如圖4。

圖4 混合酶不同處理時(shí)間下的水解率

纖維素酶與木聚糖酶混合使用以后水解率比單獨(dú)使用兩種酶的綜合效果要好，水解率在72h達(dá)到最高，但到84h時(shí)水解率有所降低，是由于水解液中細(xì)菌的生長(zhǎng)，使得水解率呈下降趨勢(shì)。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可在酶解之前對(duì)秸稈進(jìn)行滅菌處理，同時(shí)高溫也會(huì)導(dǎo)致秸稈的纖維疏松，提高水解率。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)過(guò)程先測(cè)定纖維素酶、木聚糖酶的酶活變化曲線(xiàn)，為秸稈酶解條件的選擇節(jié)省了大量的時(shí)間和精力。纖維素酶直接處理秸稈粉末，水解率最高可達(dá)27.5%。木聚糖酶單獨(dú)使用時(shí)，其最高水解率可達(dá)15%。而在兩種酶的共同作用下，最高水解率為43.1%。

生物酶法直接處理秸稈粉末，目前雖然水解率沒(méi)有使用化學(xué)方法預(yù)處理后再使用酶處理的高，但酶法條件溫和，較容易操作，對(duì)環(huán)境影響較小。是當(dāng)前比較理想的一種行之有效地秸稈處理方法。