水分脅迫對(duì)赤霞珠葡萄果實(shí)花色苷生物合成的影響

呂丹桂，謝 岳，徐偉榮，王振平

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

花色苷是一種水溶性植物色素，屬類黃酮的一個(gè)亞類，在葡萄果實(shí)表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中合成，然后運(yùn)輸?shù)揭号葜匈A藏[1]?；ㄉ盏馁|(zhì)量濃度及組分不僅影響葡萄漿果的成熟度和品質(zhì)，而且也影響葡萄酒的色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值[2-3]。此外，花色苷還具有抗氧化，防治癌癥，減輕炎癥，抗疲勞等功能[4-5]，廣泛用于醫(yī)藥及保健食品中。目前，對(duì)葡萄果實(shí)花色苷生物合成和果實(shí)著色機(jī)理的研究已較為清晰，花色苷生物合成分為2個(gè)階段：第1個(gè)階段是苯丙烷類代謝途徑，第2個(gè)階段是類黃酮途徑[6](圖1)，花色苷生物合成由結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因控制[7]，但也受溫度、光照，水分及生長調(diào)節(jié)劑等環(huán)境因素的影響[8-10]。

土壤水分質(zhì)量濃度通過影響葡萄果實(shí)類黃酮物質(zhì)的積累，從而影響葡萄與葡萄酒品質(zhì)[11]。調(diào)虧灌溉(regulated deficit irrigation，RDI)能顯著增加葡萄果實(shí)花青素和酚類物質(zhì)濃度，提高果實(shí)品質(zhì)[12]。但目前，對(duì)于葡萄水分脅迫的研究主要集中在抗旱指標(biāo)、光合特性、產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)等方面[13-14]，而對(duì)果實(shí)花色苷影響的研究較少。本研究以3 a生釀酒葡萄‘赤霞珠’(VitisviniferaL.Cabernet Sauvignon)為試驗(yàn)材料，在葡萄轉(zhuǎn)色前到成熟期，對(duì)其進(jìn)行不同水分脅迫處理，通過研究不同水分脅迫對(duì)葡萄果實(shí)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，分析花色苷合成過程中花色苷與相關(guān)基因表達(dá)量的關(guān)系，闡述水分脅迫對(duì)葡萄花色苷的調(diào)控機(jī)制，以期為釀酒葡萄水分管理及品質(zhì)提升提供理論依據(jù)和技術(shù) 指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年4月至9月在寧夏玉泉營農(nóng)場(chǎng)(38.28°N，106.24°E)國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系水分生理與節(jié)水栽培崗位試驗(yàn)基地具有調(diào)控溫濕度的玻璃溫室中進(jìn)行，以3 a生‘赤霞珠’葡萄(VitisviniferalL.Cabernet Sauvignon)為材料，采用無土限根栽培模式，葡萄種植在長4.0 m，寬0.8 m，高0.5 m的種植槽中，每槽8株，株距50 cm，杯狀整形，每株留5～6個(gè)結(jié)果梢。槽內(nèi)覆2層華盾PE耐老化(I)型棚膜，填充材料為蛭石、珍珠巖及草炭灰(1∶1 ∶1，V∶V∶V)。槽內(nèi)采用時(shí)控儀控制器進(jìn)行灌溉，每個(gè)槽有2列滴管，間距20 cm，滴管直徑2 cm，滴頭間距50 cm，流量3.1 L/min，每天8:00統(tǒng)一灌溉，灌溉液為改良霍格蘭營養(yǎng)液。

該試驗(yàn)材料2016-05-13為盛花期(full bloom，E-L23)[15]，2016-07-12為轉(zhuǎn)色期(véraison，E-L35)，于2016-07-05果實(shí)轉(zhuǎn)色前1周(花后53 d)開始試驗(yàn)處理，通過控制灌溉時(shí)間來控制灌水量，以黎明前葉片基礎(chǔ)水勢(shì)(Ψb)值大小反應(yīng)脅迫程度，根據(jù)Bahar等[16]研究，設(shè)置4個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理占用3個(gè)木槽，即代表3次生物學(xué)重復(fù)。于2016-07-12(60 d)開始采樣，每10 d采樣1次，直到2017-09-02(110 d)果實(shí)成熟期，在各種植槽的每棵植株上，隨機(jī)剪取果實(shí)，液氮速凍后，-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

PAL.苯丙氨酸裂解酶 Phenylalanin ammo-nialyase；C4H.肉桂酸-4-羥化酶 Cinnamic acid -4- hydroxylase；4CL.4-香豆酸-CoA連接酶 4-Coumarate-CoA ligase；CHS.查爾酮合成酶 Chalcone synthase；CHI.查爾酮異構(gòu)酶 Chalcone isomerase；F3H.黃烷酮3-羥化酶 Flavanone 3-hydroxylase；F3′H.類黃酮3′-羥化酶 Flavanone 3′-hydroxylase；F3′5′H.類黃酮3′5′-羥化酶 Flavanone 3′5′-hydroxylase；DFR.黃烷酮醇4-還原酶 Dihydroflavonol 4-reductase；LDOX.無色花色素雙加氧酶 Leucoanthocyanidin dioxygenase；UFGT.類黃酮葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 UDP glucose flavonoid glucosyl-transferase;OMT:O-甲基轉(zhuǎn)移酶 O-methyltran-sferase

圖1 花色苷生物合成途徑[6]
Fig.1 Anthocyanin biosynthesis pathway

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 葡萄果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)及百粒質(zhì)量測(cè)定 隨機(jī)取300粒果實(shí)稱量?？扇苄怨绦挝?TSS)質(zhì)量分?jǐn)?shù)用WYT-32型手持糖量折光儀測(cè)定?？傻味ㄋ岵捎肗aOH滴定法測(cè)定。單寧采用福林丹尼斯法[17]測(cè)定?？偡硬捎酶Ａ址臃╗17]測(cè)定。

1.2.2 總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 采用pH示差法[18]測(cè)定總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 總RNA提取和qRT-PCR 使用北京愛普拜生物有限公司的PEXBIO植物果實(shí)總RNA抽提試劑盒提取RNA。使用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。內(nèi)參基因選取Actin和EF。在Genebank中查找得到PAL、 CHS1、 F3′H、 F3′5′H、DFR、UFGT和 MybA1的特異性序列，然后登錄http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成(表2)。qRT-PCR反應(yīng)體系： 2×Ultra SYBR Mixture (CWBIO) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2 μL，引物1 μL(上游引物和下游引物各0.5 μL)。qRT-PCR反應(yīng)程序： 95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)， 72 ℃熔解擴(kuò)增產(chǎn)物7 min。所有樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)，用ddH2O代替cDNA作為NTC對(duì)照。采用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算[19]。

表1 不同處理葉片基礎(chǔ)水勢(shì)及日灌水量Table 1 Basic water potential and daily irrigation of different treatments

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft office excel 2013繪圖；采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用LSD法進(jìn)行One Way ANOVO分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水分脅迫處理對(duì)采收期葡萄果實(shí)組分的影響

由表3可知，T3百粒質(zhì)量顯著低于CK，且T1、T2和T3較CK分別降低1.5%、11.1%和25.9%，表明葡萄果實(shí)百粒質(zhì)量隨水分脅迫程度的增加而降低，過度脅迫可抑制果實(shí)生長。T1和T2的可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于CK，分別比CK高9.3%和5.7%；T3則低于CK，表明輕度和中度水分脅迫可提高果實(shí)TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)。T1和T2的可滴定酸(TA)質(zhì)量濃度低于CK，表明輕度和中度水分脅迫會(huì)降低TA的質(zhì)量濃度，而T3極顯著高于CK，說明重度水分脅迫提高了TA質(zhì)量濃度。單寧和總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為T1顯著高于CK，分別較CK增加了27.7%和 35.8%，而T2與CK差異不顯著，T3的單寧和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)則低于CK，表明輕度水分脅迫有利于單寧和總酚的積累，而重度水分脅迫抑制了單寧和總酚的積累。

處 理Treatment百粒質(zhì)量/gHundred grain mass可溶性固形物/%Total soluble solid可滴定酸/(g/L)Titratable acid 單寧/(mg/g)Tannins總酚/(mg/g)Total phenolsCK142.69±0.14 Aa20.53±0.42 ABb3.75±0.11 Bb1.48±0.03 Ab2.12±0.05 ABbT1140.49±0.16 Aab22.66±0.57 Aa3.56±0.13 Bb1.89±0.07 Aa2.88±0.07 AaT2126.84±0.33 Aab21.71±0.16 Aab3.19±0.09 Bc1.66±0.05 Aab1.97±0.12 ABbcT3105.79±0.37 Ab17.31±0.32 Bc4.50±0.04 Aa1.34±0.09 Ab1.78±0.05 Bc

注：同列不同小寫字母表示差異達(dá)到0.05顯著水平，不同大寫字母表示差異達(dá)到0.01顯著水平。

Note:Different lowercase letters in each column mean significant different at 0.05 level,different capitals mean significant different at 0.01 level.

2.2 水分脅迫對(duì)葡萄果實(shí)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

葡萄果實(shí)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著葡萄果實(shí)的成熟呈上升趨勢(shì)(圖2)。不同水分脅迫處理對(duì)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不同。從70 d至110 d，T1和T2總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于CK，在110 d達(dá)到最大，且顯著高于CK，分別為0.241%和 0.288%，T3除在70 d和80 d高于CK外，而其余時(shí)間均低于CK，表明輕度和中度水分脅迫能增加果實(shí)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，短期的重度脅迫也可以增加總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但長期的重度脅迫則不利于其積累。

2.3 水分脅迫對(duì)葡萄果實(shí)花色苷生物合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

在葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色后，與花色苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)逐漸上升后下降的趨勢(shì)(圖3)。不同程度水分脅迫處理對(duì)相關(guān)基因表達(dá)量的影響不同。T1、T2和T3處理PAL基因相對(duì)表達(dá)量從70 d至110 d均高于CK，表明水分脅迫處理導(dǎo)致PAL基因表達(dá)量的增加。T1和T2組 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因相對(duì)表達(dá)量在70 d至110 d也基本上均高于CK，但T3組基本上在100 d至110 d低于CK，表明輕度和中度水分脅迫能使 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表達(dá)量增加，而重度水分脅迫會(huì)降低果實(shí)成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表達(dá)量而降低了總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

小寫字母表示顯著差異(P≤0.05)，未標(biāo)注字母表示差異不顯著，下同

Lowercase letters mean significant differences (P≤ 0.05), unmarked letters mean no significant differences.The same below

圖2 水分脅迫下葡萄果實(shí)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)
Fig.2 Total anthocyanin mass fraction of grape berries in water stress

2.4 葡萄果實(shí)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與花色苷生物合成相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析

在果實(shí)成熟過程中，花色苷合成與其相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量具有一定的相關(guān)性(表4)，其中，PAL、 CHS1和 MybA1的相對(duì)表達(dá)量與總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)較高。水分脅迫能提高一些基因與總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性。其中，T2處理下 CHS1的相對(duì)表達(dá)量與花色苷合成呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.897，T3組PAL和 MybA1的相對(duì)表達(dá)量與花色苷合成呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.900和0.904。

圖3 水分脅迫下葡萄果實(shí)花色苷合成途徑相關(guān)基因表達(dá)量Fig.3 Gene expression of anthocyanin biosynthesis pathway in grape berries in water stress

處理 TreatmentPAL CHS1DFRUFGT MybA1CK0.692-0.0420.3090.6430.818T10.7580.5530.4050.8120.648T20.853 0.897*0.8610.6350.811T3 0.900*-0.0380.355-0.297 0.904*

注：* 表示P≤0.05水平相關(guān)。

Note:* is related to the level ofP≤ 0.05.

3 討論與結(jié)論

本研究表明，不同程度水分脅迫對(duì)葡萄果實(shí)組分影響不同，輕度和中度脅迫均降低果實(shí)百粒質(zhì)量和TA質(zhì)量濃度，提高TSS、總酚、單寧和總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而重度脅迫反之。在果實(shí)轉(zhuǎn)色后，花色苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。不同程度水分脅迫處理對(duì)相關(guān)基因表達(dá)量的影響也不同。輕度和中度脅迫上調(diào)了PAL、 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表達(dá)量，重度脅迫降低了果實(shí)成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表達(dá)量。相關(guān)性分析表明，中度脅迫 CHS1表達(dá)量與總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，重度脅迫PAL和 MybA1基因表達(dá)量與總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)。

國內(nèi)外大量研究表明，在不同物候期進(jìn)行水分脅迫能改善葡萄果實(shí)的品質(zhì)[20]。在葡萄轉(zhuǎn)色期進(jìn)行調(diào)虧灌溉會(huì)降低漿果的體積、質(zhì)量以及酸度，且顯著提高了可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和果實(shí)酚類物質(zhì)濃度[21]。本研究中，輕度和中度脅迫降低了漿果百粒質(zhì)量、可滴定酸質(zhì)量濃度，提高了可溶性固形物、單寧和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與前人研究結(jié)果相一致。李云飛等[22]發(fā)現(xiàn)重度干旱會(huì)降低紫葉矮櫻葉片可溶性糖和花青素質(zhì)量濃度。本研究中重度脅迫降低了果實(shí)可溶性固形物、單寧和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與其研究結(jié)果相似，這可能是由于重度脅迫抑制了植株的生長發(fā)育及代謝。Ollé等[23]發(fā)現(xiàn)無論在轉(zhuǎn)色前還是在轉(zhuǎn)色后對(duì)葡萄植株進(jìn)行水分脅迫，都會(huì)增加果實(shí)花色苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但花色苷組分有所不同。本研究中，轉(zhuǎn)色前輕度和中度脅迫處理均增加了總花色苷積累量，這與前人研究結(jié)果一致。但是，重度脅迫卻降低了總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，這可能是由于花色苷的積累與葡萄果實(shí)糖的積累有關(guān)[24]，而重度脅迫會(huì)降低葡萄果實(shí)糖的積累，導(dǎo)致花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

周莉等[25]研究表明，從轉(zhuǎn)色期開始，葡萄果實(shí)花色苷生物合成轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，在果實(shí)完熟后，轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。本研究中，葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色至成熟，與花色苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與其研究結(jié)果一致。水分脅迫會(huì)改變花色苷生物合成過程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并上調(diào)葡萄花色苷合成途徑 F3H、DFR、UFGT、 F3′H、 F3′5′H和GST基因的表達(dá)[26]。本研究中，輕度和中度脅迫使PAL、 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表達(dá)上調(diào)，與前人研究結(jié)果一致。而重度脅迫降低了果實(shí)成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表達(dá)量。因此，重度脅迫導(dǎo)致總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，可能是由于UFGT是催化不穩(wěn)定的花色素糖基化形成穩(wěn)定的花色苷-3-葡萄糖苷的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因[27]，且重度脅迫顯著降低了果實(shí)糖質(zhì)量濃度。花色苷生物合成中相關(guān)基因表達(dá)量與總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化具有相關(guān)性[28-29]。本試驗(yàn)表明，中度脅迫 CHS1表達(dá)量與總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，重度脅迫PAL和 MybA1基因表達(dá)量與總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)也呈顯著正相關(guān)，這也驗(yàn)證了前人的結(jié)果，并且水分脅迫提高一些基因表達(dá)量與花色苷總量的相關(guān)性。

水分脅迫通過控制葡萄植株的生長發(fā)育改善葡萄漿果的成熟度，調(diào)節(jié)葡萄花色苷生物合成過程中相關(guān)基因的表達(dá)從而提高了葡萄果實(shí)總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)也提高了水分利用效率[30-31]。本研究表明，輕度和中度脅迫有利于葡萄漿果品質(zhì)的改善，促進(jìn)了葡萄果實(shí)花色苷的生物合成，與對(duì)照相比分別節(jié)約灌水38.2%和69.1%，建議在生產(chǎn)中減少灌水，以達(dá)到合理的水分脅迫之目的，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒提供優(yōu)質(zhì)原料。