基于 28S rDNA D2區(qū)序列的陜南凹緣菱紋葉蟬分子系統(tǒng)學與遺傳多樣性研究

楊金宏，孔衛(wèi)青

(安康學院，陜西省蠶桑重點實驗室, 陜西安康 725000)

凹緣菱紋葉蟬(HishimonussellatusUhler)俗稱綠頭菱紋葉蟬，隸屬于昆蟲綱(Insecta)半翅目(Hemiptera)葉蟬科(Cicadellidae)殃葉蟬亞科(Euscelinae)[1]。凹緣菱紋葉蟬是桑樹黃花型萎縮病、棗瘋病等的重要媒介昆蟲，在中國分布廣泛[2]。成蟲和若蟲均可造成危害。它們以口針刺吸病樹汁液，亦將病原吸入體內，后者移至唾液腺并繁殖；再次取食時病原菌傳入新寄主，從而導致健康植株發(fā)病。桑樹染病后通常會出現(xiàn)花變葉、矮化、黃化、衰退、簇生、叢枝、小葉等癥狀，嚴重影響蠶桑產業(yè)的健康發(fā)展。凹緣菱紋葉蟬每年4月下旬至10月下旬發(fā)生危害，1 a達3～4代，繁殖速度快，世代周期短，世代重疊，危害嚴重，且與養(yǎng)蠶周期重合，難以防治。

秦巴山區(qū)有眾多的小盆地和山間谷地相連接，安康市漢濱、石泉、漢陰、平利、紫陽等縣(區(qū))和漢中市西鄉(xiāng)、勉縣等均位于該地理區(qū)域，形成陜南蠶桑產業(yè)主產區(qū)。各地自然地理條件差異較大，具有很高的環(huán)境異質性。桑園種植多分布于坡地和山地，可能阻礙凹緣菱紋葉蟬擴散，形成地理隔離，進而導致不同種群間受到不同的選擇壓力而出現(xiàn)種群分化。隨著近年來國家退耕還林、土地流轉政策以及蠶桑產業(yè)生產模式的變更，較多的連片桑園和強村大戶出現(xiàn)，這為凹緣菱紋葉蟬擴散和傳播提供了條件。為了解陜南桑園凹緣菱紋葉蟬種群的遺傳信息，分析其分布特點，本研究利用 28S rDNA基因D2區(qū)對其種群遺傳結構和遺傳分化進行分析。

28S rDNA存在于編碼細胞質核糖體大亞基中，在生物體內含量較高，在進化過程中比較保守，堿基替換率低，是研究生物系統(tǒng)發(fā)育較好的分子標記[3-4]。同時在 28S rDNA基因的保守序列中，含有12個高變區(qū)D1～D12，可解釋從屬到科級水平上的系統(tǒng)發(fā)生關系以及屬種間的親緣關系[5-8]，是非常有用的遺傳進化分析工具。Dietrich等[9]用 28S rDNA D2～D10區(qū)序列分析角蟬總科(Membracoidea)與葉蟬科的親緣關系。戴仁懷等[10]利用 28S rDNA基因 D2區(qū)、 16S rDNA序列和形態(tài)特征對中國角頂葉蟬亞科(Deltocephalinae)的系統(tǒng)發(fā)育進行研究。目前，未見利用 28S rDNA基因對凹緣菱紋葉蟬進行分子系統(tǒng)學和遺傳多樣性研究的報道。本試驗嘗試這項研究，其結果將促進對陜南蠶桑產區(qū)凹緣菱紋葉蟬的種群遺傳結構及其分布概況的了解，并為凹緣菱紋葉蟬相近種的分類和快速分子診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年9月至10月，用黃板誘蟲法采集秦巴山區(qū)陜南各蠶桑區(qū)凹緣菱紋葉蟬成蟲。采集的新鮮標本浸泡于φ=75% 乙醇中，于12 h內置于-20 ℃的冰箱保存，備用。樣品采集地點及相關信息見表1。

表1 陜南凹緣菱紋葉蟬種群樣本采集地及其數(shù)量Table 1 Locality and sample size of Hishimones sellatus populations in South Shaanxi

1.2 基因組DNA提取

1.3 PCR擴增及測序

目標片段擴增用28S D2～D3引物[9]完成，引物序列為：28SD2F：5′-AGTCGKGTTGCTT-GAKAGTGCAG-3′；28SD2R：5′-TTCAATT-TCATTKCGCCTT-3′。反應總體系50 μL，包括基因組DNA 2.0 μL，10×PCR擴增緩沖液5.0 μL，Mg2+(25 mmol/μL)5.0 μL，dNTPs(10 mmol/μL)1.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，高保真TaqDNA聚合酶(5 U/μL)1.0 μL，加雙純水補足至50.0 μL。PCR擴增程序為[8]：94 ℃預變性3 min，36×(94 ℃變性1 min，52.2 ℃退火 1 min，72 ℃延伸50 s)，72 ℃終延伸10 min。取 3.0 μL PCR擴增產物進行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，檢測成功后直接送生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化測序。

1.4 序列多樣性分析

以Clustal X 1.83軟件[11]基于鄰接法(Neighbor-joining)對所得序列進行比對，去除兩端不準確序列后，最終輸出fasta格式的對齊序列。利用Dnasp 61101軟件[12]統(tǒng)計各序列間的堿基組成、變異位點，以及基于對齊序列的種群核苷酸多樣性Pi[13]、單倍型多樣性Hd[Hd=n(1-∑Pi2)/(n-1)，其中n為樣本數(shù)]和種群遺傳分化系數(shù)等，利用Tajima’sD方法對序列進行中性檢驗，并根據(jù)數(shù)值服從β分布的特點，利用隨機抽樣模擬的種群中性進化為零假設，通過與觀測值的比較進行顯著性檢驗[14]。

1.5 種群間遺傳差異分析

利用Arlequin 3.5.22軟件[15]，基于Locus-by-Locus模型分析種群變異的分子方差AMOVA(Analysis of molecular variance)以及種群間的固定系數(shù)Fst(F-statistics)，以成對單倍型差異比較法(Pairwise difference)計算種群間遺傳距離。運行Dnasp 61101軟件[12]計算種群間的基因流系數(shù)Nst(Population subdivision at the nucleotide level)和種群間的地理距離(D)，Nst= 1 /(1 + 2Nm)；D= 111.199{(a1-a2)2+ (b1-b2)2cos2[(a1+a2) / 2]}1/2，其中Nm為有效遷移個體數(shù)，a和b分別代表經度和緯度，并進一步計算D的自然對數(shù)值以及與Nst之間的決定系數(shù)(R2)。

采用Bandelt等[16]的Median-joining模型繪制單倍型間的網絡進化圖，以葉蟬科角頂葉蟬亞科的Dwightlaacutipennis作外群，MEGA 7.0.26軟件[17]運行ML極大似然法構建各個單倍型的系統(tǒng)進化樹，采用的堿基替換模型為GTR+G，各分支置信度以1 000次自展重復進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 凹緣菱紋葉蟬 28S rDNA D2區(qū)序列的特征及多樣性

經檢測，提取的132頭凹緣菱紋葉蟬的總DNA全部合格； 28S rDNA基因D2區(qū)片段的PCR擴增和純化測序，均獲得良好的測序結果。測序序列比對并去除2端不準確序列后，得到包括缺失位點的有效片段695 bp(Alignment score=138 469)，序列比對結果顯著性檢驗P值為 0.001～0.041。綜合所有的多樣性位點共定義8個單倍型(圖1)，其中存在多態(tài)性位點63個，突變67個；其中4個位點存在3種變體，59個位點有2種變體。分析各單倍型序列數(shù)和地理分布，H_1有98條序列(表2)，占序列總數(shù)的 74.2%，且都存在于所有7個地理種群中，為優(yōu)勢共享單倍型；H_2和H_3僅在1個種群中出現(xiàn)，為私有單倍型。各種群內單倍型的分布從1種～6種不等，其中3號種群最多6種，且出現(xiàn)29個個體共享1個單倍型，具有較高的保守性。核苷酸位點多樣性Pi和單倍型多樣性指數(shù)Hd分別從核苷酸的突變位點數(shù)和差異基因型兩個層面展示種群的遺傳多樣性。7個種群的Pi分布為0～ 0.019 03，Pi最高的是3號種群，Hd為0～ 0.581 82，7號種群最高(表2)。Tajima’sD中性檢驗是基于等位基因頻率和單倍型數(shù)目變化差異的一種種內自然選擇檢驗方法，對每一個種群和總群體進行檢驗(表2)，發(fā)現(xiàn)除4號種群大于0外，其他種群均為負數(shù)，其中5號種群為 -2.222 40，且顯著性檢驗P<0.01，說明該種群受到強烈的負選擇影響[14]。

圖1 28S rDNA基因D2區(qū)序列單倍型及變異位點信息Fig.1 Haplotypes and variation sites of 28S rDNA D2 region sequence

地理種群Geographic population核苷酸多樣性(Pi)Nucleotide diversity單倍型多樣性(Hd)Haplotype diversity單倍型數(shù)量及其分布Haplotype number and distribution中性檢驗Tajima’s DP值P value10.015 240.466 67H_1(15), H_7(2), H_8(4), -0.520 080.320200H_1(7)30.019 030.553 91H_1(29), H_4(3), H_5(2), H_6(3), H_7(3), H_8(4)-0.213 670.42940.013 680.485 29H_1(12), H_3(3), H_8(2)0.260 430.67350.006 510.166 67H_1(11), H_5(1)-2.222 40*0.00160.008 420.278 95H_1(17), H_4(1), H_6(2)-0.798 470.27970.013 260.581 82H_1(7), H_2(2), H_5(2)-0.191 360.445合計 Total0.013 780.440 40H_1 ～ H_8-0.742 410.450

注：“( )”中的數(shù)字代表葉蟬數(shù)目?！?”表示差異顯著。

Note: Numbers in “( )” represent the number of leafhoppers.“*” indicate significant difference.

2.2 種群遺傳差異分析

Excel軟件計算基因流系數(shù)Nst和種群地理距離D的自然對數(shù)間的決定系數(shù)(R2)，可知R2=0.019 7(P<0.001)，接近于0，說明該基因在本研究范圍內與各個種群之間的基因流動和地理距離不相關，可能存在網狀基因交流。

2.3 單倍型進化分析

Median-joining模型是在maximum-parsimony模型[20]和Kruskal’s算法[21]基礎上發(fā)展的，據(jù)此繪制的進化圖呈網狀分布。本研究的凹緣菱紋葉蟬 28S rDNA D2區(qū)8種單倍型間的進化網絡圖呈線狀分布(圖2)，在所有的8個單倍型中，只有H_4和H_1是種內網絡進化圖中的中間單倍型[22]，其他單倍型均處于進化網絡邊緣，通過6個缺失的中間單倍型(mv1～mv6)連接，這與各單倍型在各個地理種群的分布結果一致(表2)，說明凹緣菱紋葉蟬的地理聚集性不強，交叉散布于整個進化網絡圖中。

灰色圓圈代表單倍型 Grey circle represents the haplotype; 灰色圓圈面積代表單倍型相對頻率 The size of grey circle represents the relative frequency; 實心黑點代表中間單倍型 Solid black spots represent intermediate haplotype; 文本框內數(shù)字代表單倍型間的突變位點數(shù) Boxed numbers represent the mutation sites between haplotypes

圖2 基于 28S rDNA基因的D2區(qū)的8個單倍型的Median-joining 網絡關系圖
Fig.2 Median-joining network of eight haplotypes based on 28S rDNA Gene D2 region sequences

進一步以葉蟬科角頂葉蟬亞科的Dwightlaacutipennis的 28S rDNA D2區(qū)(JX845493.1)作外群，構建單倍型的ML系統(tǒng)進化樹，結果其 log likelihood值為-1 474.09。自展支持值bootstrap法是對初始DNA數(shù)據(jù)進行放回抽樣生成偽樣本，進而估計節(jié)點可靠度的一種非參數(shù)方法，本研究節(jié)點的自展支持值均大于90，且與網絡進化圖的聚集特征一致，進化關系較為可靠。根據(jù)外群的節(jié)點位置，進化樹中單倍型H_1、H_2、H_7、H_8形成一個分支，H_3～H_6形成一個分支，其中H_7的枝長最長，堿基替換率最高，說明其與其他單倍型的實際進化距離最遠(圖3)。

枝長代表堿基替換率 Branch lengths measured in the number of substitutions per site

圖3 基于 28S rDNA D2區(qū)的單倍型的ML系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 ML phylogenetic tree of haplotypes based on 28S rDNA D2 region

3 討 論

種群為適應不同地域的自然環(huán)境而獨自演化，可能出現(xiàn)地理種群的遺傳分化和形態(tài)變異[23]，基于 28S rDNA基因D2區(qū)對陜南桑園凹緣菱紋葉蟬各種群和總群體進行Tajima’sD中性檢驗和顯著性分析，結果表明該種群和總群體近期沒有受到正選擇的影響，5號種群受到負選擇的影響，種群中存在較多的低頻率等位基因，而其他種群等位基因頻率處于穩(wěn)定狀態(tài)，遵循中性進化模型[14]。陜南桑園凹緣菱紋葉蟬 28S r DNA基因D2區(qū)的核苷酸多樣性指數(shù)處于較低水平，變異主要來自種群內且差異不顯著，表明該群體的大部分差異是隨機分布，且存在廣泛的基因交流。

選擇恰當?shù)耐馊杭从H緣關系合適的外源物種，是進化樹分析的關鍵，外群選擇不當，容易造成進化樹的拓撲結構發(fā)生變化[24]。葉蟬科被分為16個亞科，亞科內部的親緣關系知之甚少，且不同亞科間可能存在許多并系[25]。因此本研究首先以蝽科昆蟲為外群，分析整個葉蟬科的DNA序列，分析獲得角頂葉蟬亞科是分析凹緣菱紋葉蟬的合適外群。以此構建的進化樹各節(jié)點的自展支持值均大于90%，且與網絡圖一致，說明該外群的選擇是合適的。

基因流是種群間基因通過個體或其配子遷移到其他種群而導致等位基因頻率發(fā)生變化的現(xiàn)象，是影響種群間和種群內遺傳變異的主要因素[26]。本研究種群內的變異遠大于種群間，說明種群間的基因流增加了種群間的相似度和種群內的變異度，也是陜南桑園凹緣菱紋葉蟬沒有形成地理格局的原因?；蛄骱偷乩砭嚯x之間的相關性分析顯示，該基因區(qū)域各個種群之間的基因流動和地理距離不相關，出現(xiàn)這種狀況的原因，一方面可能與凹緣菱紋葉蟬具有一定的飛行能力和遷飛的習性有關[27]，成蟲和若蟲能夠適應各種桑園生態(tài)環(huán)境，能夠漸次或連續(xù)發(fā)生一些近距離的擴散，導致不同地理種群間發(fā)生遺傳物質的交流。另一方面可能是人類生產活動比如桑苗等宿主植物遠距離運輸?shù)鹊淖饔谩?/p>