一個玉米葉夾角突變體的表型鑒定及遺傳分析

王曉娟，何海軍，劉忠祥，楊彥忠，寇思榮，連曉榮，周玉乾，周文期

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 作物研究所，蘭州 730070)

葉夾角，定義為葉片中脈與莖之間的傾角，是影響光截留、光合效率和種植密度的最重要的冠層結構參數(shù)之一。玉米葉夾角與產(chǎn)量的關系也早有報道，與1930年至1960年代的歷史材料相比[1]，直立葉片與大的葉面積指數(shù)的結合使現(xiàn)代玉米雜交種在光能捕獲能力上提高14%。這種增加的光捕獲能力以超過20%的增產(chǎn)效果體現(xiàn)出來[2]。其他研究也報道了葉夾角對籽粒產(chǎn)量直接影響的相似結果，如早在20世紀90年代釋放的品種中，隨著葉夾角從60°到30°的降低，產(chǎn)量提高了15%～30%[3]。這些研究為葉夾角的改善對于增加光捕獲以及增產(chǎn)效應提供了豐富的試驗證據(jù)。與此同時，前人對葉夾角的遺傳規(guī)律做了比較深入的研究，對葉夾角的自然變異的研究報道有很多[4-5]，這些研究表明，葉夾角是受到多個基因或者多個位點共同調(diào)控的一個復雜數(shù)量性狀，認為加性基因效應最為重要，同時也受非加性基因效應影響[6-7]。因此，葉夾角性狀的遺傳分析對葉夾角的遺傳基礎、形成機制以及育種材料的遺傳改良都具有重要意義。

BSA (Bulked segregant analysis)是尋找與目標QTL/基因連鎖標記的一種簡單快速的方法[8]。隨著標記種類和密度的增多以及NGS(Next-generation sequencing)技術的發(fā)展， BSA策略被廣泛的應用于主效QTL/基因的定位[9-10]。目前，該技術在擬南芥、水稻、大豆、小麥、玉米、高粱、向日葵等多種植物中的應用都有大量報道，并且鑒定到了很多重要性狀的QTL/基因[11-16]。甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所玉米研究室前期工作中，發(fā)現(xiàn)了一個以自交系‘LY8405’為背景葉夾角顯著減小的突變體材料，并命名為‘FU1603’。本研究中將‘FU1603’和玉米自交系‘B73’(參考基因組測序系)進行雜交，構建了F2群體，根據(jù)群體表型分離，經(jīng)卡方檢驗確定該突變?yōu)閱蝹€核基因控制的隱性突變；進一步利用BSA的方法將該位點定位于玉米第1號染色體的 1.02 bin上大約9 Mb的物理區(qū)間內(nèi)。該位點是一個新的控制玉米葉夾角的基因位點，為后續(xù)該突變基因的精細定位和克隆奠定了良好的工作基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米自交系‘B73’和‘LY8405’，突變體材料‘FU1603’，以及‘B73’和‘FU1603’為親本構建的F2分離群體。

1.2 田間試驗

將‘LY8405’‘FU1603’‘LY8405×FU1603’F1、‘B73×FU1603’F1，以及F1自交產(chǎn)生的F2分離群體分別于2017年春種植在甘肅省張掖市試驗基地以及2017年冬種植在海南省三亞市荔枝溝試驗基地，行長5 m，寬0.6 m，每行種植20株。

1.3 農(nóng)藝性狀觀察分析

在開花散粉高峰期對‘LY8405’和‘FU1603’各個農(nóng)藝性狀進行觀察，包括：株型(株高、穗位高、葉片數(shù)、節(jié)間數(shù)、穗三葉以及倒三葉葉夾角)、穗部性狀(雄穗長、雄穗分枝數(shù)、雌穗長、雌穗粗、穗行數(shù)、軸粗)、籽粒(粒長、粒寬、百粒質(zhì)量)等，采用t-test檢驗差異顯著性。

1.4 突變體遺傳分析

通過‘LY8405×FU1603’F1植株表型分析以及‘LY8405×FU1603’F2和‘B73×FU1603’F2分離群體中野生型及突變體植株數(shù)目統(tǒng)計分析，結合卡方測驗來判斷該突變體的遺傳模式。

1.5 突變位點的初定位

利用BSA的方法對葉夾角突變基因進行初定位。首先，將‘FU1603’與‘B73’進行雜交，產(chǎn)生F1，并將F1進行自交，構建F2分離群體。F2分離群體中突變體鑒定的主要依據(jù)葉夾角、卷曲程度等性狀的整體表現(xiàn)，葉夾角較小、葉片較小且出現(xiàn)卷曲的為突變體，反之為野生型。從田間選取15株突變體表型植株，提取DNA等量混合，構建一個“突變體池”；同時，另外選取15株表型正常的植株，提取DNA等量混合，構建一個“野生型池”。利用甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所玉米研究室已經(jīng)合成的均勻覆蓋玉米基因組的 1 000對SSR引物，對2個DNA池進行擴增，毛細管電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，篩選多態(tài)性的標記，即與突變基因緊密連鎖的標記。然后利用160株左右的F2分離群體對多態(tài)性標記進行共分離驗證，并準確定位突變基因所在的區(qū)間。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2013 軟件對數(shù)據(jù)進行整理、統(tǒng)計分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 玉米葉夾角突變體‘FU1603’田間表型調(diào)查分析

‘FU1603’來源于自交系‘LY8405’的一個自然突變，該突變體表現(xiàn)為葉夾角減小、且葉片卷曲皺縮等表型(圖1-A)。通過自交繁殖，自交后代也表現(xiàn)出與上一代同樣穩(wěn)定的表型特征，說明該位點已經(jīng)純合并且能夠穩(wěn)定遺傳。通過田間植株觀察發(fā)現(xiàn)，突變體在5葉期以后開始出現(xiàn)葉片皺縮卷曲的表型，之后葉片卷曲皺縮表型越來越明顯，與‘LY8405’葉片的表型差異顯著；通過對穗三葉以及倒三葉的葉夾角進行考察，結果顯示，與野生型‘LY8405’相比，突變體‘FU1603’的穗位葉、穗下葉以及穗上葉的葉夾角顯著變小(圖1-A和圖1-B)，而倒三葉的葉夾角在2個材料中差異不顯著(圖1-C，表1)。

2.2 玉米葉夾角突變體‘FU1603’和野生型‘LY8405’農(nóng)藝性狀比較分析

在成株期，與‘LY8405’相比，‘FU1603’的株高和穗位高顯著降低(P<0.05)，其中株高降低約15 cm，穗位高降低約6 cm(圖1-A和圖1-B，表1)。然而，節(jié)間數(shù)在2個材料間卻沒有顯著差異(P>0.05)。此外，與‘LY8405’相比，‘FU1603’雄穗長、雄穗分枝數(shù)、雌穗長、穗粗、穗行數(shù)以及軸粗等性狀顯著降低(P<0.05)，因此‘FU1603’雌雄生殖器官都顯著減小。籽粒相關性狀分析結果顯示，盡管百粒質(zhì)量不存在顯著差異，但粒長與粒寬都存在顯著差異，與‘LY8405’相比，‘FU1603’粒長顯著降低，粒寬顯著增加。綜上所述，與‘LY8405’相比， ‘FU1603’突變體的株型、穗部性狀以及籽粒等多個農(nóng)藝性狀值均發(fā)生了顯著的改變。

2.3 玉米葉夾角突變體‘FU1603’的遺傳模式分析

‘LY8405×FU1603’F1和‘B73×FU1603’F1單株的葉夾角以及葉片相關性狀均與野生型‘LY8405’相同，沒有任何差異，因此‘FU1603’為一個隱性突變；將F1自交，獲得F2分離群體，通過卡方檢驗發(fā)現(xiàn)野生型植株與突變體植株的分離比例符合3∶1(表2)，表明該突變體是受單個核隱性基因控制的。

A.散粉期的‘LY8405’及‘FU1603’ The plants of ‘LY8405’ and ‘FU1603’ during reproductive development stage；B.營養(yǎng)生長中的‘LY8405’及‘FU1603’ Performance of ‘LY8405’ and ‘FU1603’ during the vegetative growth stage in the field；C.‘LY8405’及‘FU1603’葉夾角統(tǒng)計分析(t-test) Statistical analysis of leaf angle between ‘LY8405’ and ‘FU1603’ by t-test；“***”代表P< 0.001，NS代表P>0.05 “***” indicatesP<0.001,NS indicatesP>0.05

圖1 葉夾角突變體‘FU1603’以及野生型‘LY8405’的表型
Fig.1 Phenotype of ‘FU1603’ and ‘LY8405’

性狀TraitsLY8405FU1603Pr>|t|單株數(shù)(LY8405/FU1603)Plant number株型 Plant architecture株高/cm Plant height194.2±15.8179.1±15.02.2E-0536/31穗位高/cm Ear height70.2±8.264.3±5.62.1E-0436/31節(jié)間數(shù) Internode number21.9±0.822.2±1.00.0536/30雄穗 Tassel雄穗分枝數(shù) Tassel branch number8.4±1.96.8±1.31.3E-0436/30雄穗長/cm Tassel length25.1±3.314.5±1.22.7E-2536/30雌穗 Ear穗長/cm Ear length12.1±0.88.4±0.91.8E-1417/17穗粗/cm Ear diameter4.2±0.13.5±0.32.1E-1017/17穗行數(shù) Kernel row number16.9±1.011.9±1.53.4E-1317/17軸粗/cm Cob diameter2.7±0.12.4±0.11.6E-0917/17籽粒 Kernel粒長/mm Kernel length12.0±0.310.3±0.32.0E-1011/11粒寬/mm Kernel width6.5±0.27.6±0.26.9E-1011/11百粒質(zhì)量/g 100-kernel mass26.3±0.526.2±0.40.611/11

注：Pr>|t|為雙樣本t測驗的概率值。

Note:Pr>|t| is probability oft-test between two independent samples.

2.4 玉米葉夾角突變體‘FU1603’的突變位點初定位

利用F2群體中的極端單株構建的2個混合DNA池，采用BSA的方法對該突變位點進行初定位。通過均勻分布在玉米10條染色體的 1 000對SSR標記在“突變體”DNA池以及“野生型”DNA池中的多態(tài)性分析，最終篩選到了3對多態(tài)性的標記，即C1-2、C1-16和C1-18(圖2)；這3對標記都是在野生型池中有雙帶，而在突變體池中只存在單條帶，因此這3對標記很可能與‘FU1603’突變位點緊密連鎖，而且這3對標記都位于玉米第1號染色體1.02 bin上(表3)，根據(jù)‘B73’ V4版本參考基因組顯示，3個標記在染色體上的順序依次為：C1-16、C1-18和C1-2,物理位置分別為：15061072、17966407和26885514 (表3)。

表2 玉米葉夾角在2個F2群體中分離比例的卡方測驗Table 2 Chi-square test of segregation ratio of leaf angle in two F2 populations

用篩選到的與‘FU1603’突變位點連鎖的3對SSR標記分析160個F2單株的基因型，并結合這些單株的表型，驗證上述3對標記與突變位點是否真實連鎖，結果顯示，C1-16與表型的交換頻率為0.11，C1-18與表型的交換頻率為0.06，C-2與表型的交換頻率為0.04(表3)。根據(jù)連鎖標記與表型的交換頻率，驗證了BSA結果真實可靠，并且突變位點更加靠近于標記C1-2。進而根據(jù)交換單株的基因型信息，將‘FU1603’的突變位點定位于標記C1-18與C1-2之間約9 Mb的物理區(qū)間內(nèi)(表4)。

W.野生型池 Wild-type bulk；M.突變體池 Mutant bulk

表3 連鎖標記信息以及與突變位點的交換頻率Table 3 The information and exchange frequency between linkage markers and mutation sites

表4 重組單株基因型以及表型信息Table 4 The genotype and phenotype of the recombinant plants

注：B.突變體‘FU1603’的基因型；H.雜合基因型。

Note:B.genotype of ‘FU1603’; H.genotype of Heterozygous.

3 討 論

葉夾角突變體的發(fā)掘與研究為玉米的株型育種以及高密度育種提供了重要的種質(zhì)資源。葉夾角對產(chǎn)量存在兩個方面的貢獻，其一是對光的截獲效率的提高，其二是種植密度的提高[17-18]。迄今為止，科研工作者利用玉米突變體材料已經(jīng)克隆了一批葉夾角相關的基因，如，Strable等[19]發(fā)現(xiàn)了一種具有葉片結構變異的玉米突變體，并將其命名為drooping leaf1 (drl1)，drl1突變影響葉長和寬度、葉角、節(jié)間長度和直徑，是一個多效基因。Moreno等[20]對lg1突變體的研究發(fā)現(xiàn)，該突變體為lg1基因表達缺失突變體，該突變體表現(xiàn)為葉片直立、不能形成葉舌和葉耳，葉片和葉鞘的連接處不能正常發(fā)育。lg2編碼一個亮氨酸拉鏈蛋白，該基因的突變導致葉夾角減小，葉耳葉舌缺失或者異常，葉片與葉鞘連接處彌散狀[21]。lg1和lg2兩個突變體密度與產(chǎn)量的試驗研究闡明葉夾角和種植密度的關系：lg1基因型擁有幾乎直立的葉片，在極端密度(151 000株/hm2)仍然具有較高的產(chǎn)量，lg2雖然沒有極端小的葉夾角，但它擁有著比較大的光截獲效率，因此具有最高的產(chǎn)量[22]。而本研究中所鑒定到一個新的葉夾角突變體‘FU1603’，其在穗三葉的葉夾角都顯著減小，株型更加緊湊，具有耐密植的特性；同時籽粒產(chǎn)量性狀分析結果表明，粒型雖然發(fā)生了改變，但百粒質(zhì)量沒有顯著變化，即突變體與野生型相比，籽粒產(chǎn)量沒有發(fā)生改變，但耐密植性顯著改善，因此，‘FU1603’突變材料的發(fā)現(xiàn)，為玉米株型育種、密度育種及提高玉米產(chǎn)量都提供了很好的資源。

BSA是突變體快速定位及克隆定位的一個重要工具，利用分離群體野生型和突變體2個DNA池就能夠找到突變位點的大概位置所在，簡單快速，并且節(jié)約成本。Cai等[23]采用BSA的方法快速將一個控制玉米籽粒發(fā)育的突變體emp10定位到玉米1號染色體靠近末端的位置，并成功克隆了該基因。Zhang等[24]采用BSA的策略將控制玉米莖頂端組織發(fā)育的突變體gif1定位于1號染色體，并成功克隆了該基因。Han等[25]發(fā)現(xiàn)了一個玉米多性狀突變體muw，并通過BSA的方法將該位點定位于玉米第2號染色體靠近著絲粒的位置，最終發(fā)現(xiàn)該位置存在著一個約5 Mb的大片段缺失。本研究中，同樣采用了F2分離群體的野生型和突變體各15株，創(chuàng)建了2個DNA池，用1 000對SSR引物成功的篩選到了與之緊密連鎖的標記，并進一步通過分離群體的共分離分析及交換重組單株的分析將一個新的控制葉夾角的基因定位于玉米第一染色體1.02 bin約9 Mb的物理區(qū)間內(nèi)，本研究獲得的結果為新的玉米葉夾角基因的精細定位和克隆奠定了良好的工作基礎。