基于銀耳轉(zhuǎn)錄組測序的多糖代謝途徑分析

王 東，牛 蓓，宋 君，趙樹海，雷紹榮，郭靈安，張富麗，劉文娟，常麗娟，趙黎明

(1．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川 成都 610066；2.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106；3.巴中市通江銀耳科學(xué)技術(shù)研究所，四川 通江 636700；4.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066)

【研究意義】銀耳(Tremellafuciformis)又稱白木耳、雪耳，為擔(dān)子菌門銀耳屬中溫好氣性真菌，是我國傳統(tǒng)藥食兼用真菌[1]。人們通常所稱的銀耳實(shí)為銀耳的子實(shí)體，由銀耳菌絲和香灰菌共生發(fā)育而來，為白色或略帶黃色，膠質(zhì)半透明。中醫(yī)認(rèn)為銀耳性平，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等經(jīng)典專著中均有記載，具有補(bǔ)腎、潤肺、生津、止咳的功效。銀耳在我國分布較為廣泛，已有幾百年的栽培史，其中以四川通江和福建古田兩地最為著名[2]。作為重要的藥食真菌，優(yōu)良銀耳菌株的選育成為支撐銀耳產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要內(nèi)容。但在實(shí)際生產(chǎn)中，銀耳品種老化、退化等現(xiàn)象十分嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了銀耳品質(zhì)的提升[3]。因此，為提高銀耳品質(zhì)，有必要對其有效成分的合成途徑及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，以此來指導(dǎo)銀耳品種培育和科學(xué)生產(chǎn)。【前人研究進(jìn)展】銀耳營養(yǎng)豐富，含有多種人體必需氨基酸，以及鈣、鐵等多種礦物質(zhì)?，F(xiàn)代研究表明，銀耳的主要活性成分是以α-(1→3)-D-甘露糖為主鏈的雜多糖，其具有抗輻射、抗氧化、提高人體免疫功能、延緩衰老，抑制腫瘤等多種作用[4-6]。根據(jù)單糖的種類不同，多糖可分為同型多糖和異型多糖[7]。典型的多糖合成基因簇一般包括糖核苷酸合成相關(guān)基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和多糖合成調(diào)節(jié)基因[8]。盡管各種多糖的具體結(jié)構(gòu)不同，但共同的特點(diǎn)是都由常見的單糖重復(fù)單元組成，不同微生物細(xì)胞體系中多糖合成代謝的基本途徑十分相似。作為影響銀耳品質(zhì)的關(guān)鍵成分，目前大量研究集中在多糖的結(jié)構(gòu)、藥理及其分離純化技術(shù)方面，而對銀耳多糖在分子水平上的合成機(jī)制報(bào)道甚少。針對銀耳的分子生物學(xué)研究主要集中在遺傳轉(zhuǎn)化、基因克隆、分子標(biāo)記等方面，而在基因組學(xué)方面的研究很少[9]。因此，弄清銀耳多糖合成機(jī)制將對銀耳品質(zhì)生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也將為進(jìn)一步挖掘其它多糖合成途徑及關(guān)鍵基因提供了參考依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以四川和福建兩種銀耳菌絲體為研究材料，運(yùn)用Illumina測序技術(shù)進(jìn)行銀耳菌絲體轉(zhuǎn)錄組測序分析，對unigene序列進(jìn)行注釋，全面分析了銀耳轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究將為銀耳分子標(biāo)記開發(fā)和重要性狀的功能基因克隆等提供數(shù)據(jù)，也將為銀耳品質(zhì)遺傳工程改良和育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

銀耳菌株T1(四川通江銀耳)和F3(福建古田銀耳)收集自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院土壤肥料研究所，經(jīng)分離和純化后獲得菌絲體，對菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)后收集，每個(gè)菌株培養(yǎng)3份。

1.2 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)對6個(gè)樣品進(jìn)行總RNA提取，經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)進(jìn)行質(zhì)檢合格后。將質(zhì)檢合格的總RNA按照菌株進(jìn)行合并，獲得2個(gè)測序樣本，并對總RNA進(jìn)行純化。按照Illumina上機(jī)測序要求，對純化后的Total RNA進(jìn)行系列操作，包括mRNA的分離或rRNA去除、片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、末端修復(fù)、3’末端加A、連接接頭、富集等步驟。使用Qubit?2.0 Fluorometer 檢測濃度對所建文庫進(jìn)行濃度測定。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序及處理

按照HiSeq 2500高通量測序平臺(tái)操作流程對銀耳樣品轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行測序，獲得進(jìn)行雙端測序結(jié)果，將獲得的序列進(jìn)行可信度分析和質(zhì)量評(píng)估。剔除低質(zhì)量序列(N 的比例大于5 %，20 %以上為Q≤10 的序列)和接頭(adaptor)序列，獲得clean reads。通過Trinity進(jìn)行序列組裝，獲得unigenes作為后續(xù)分析序列。

1.4 測序數(shù)據(jù)注釋

將得到的unigene序列運(yùn)用Blastx與Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，篩選條件為E-value<1E-5。unigene與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG和KEGG 數(shù)據(jù)庫比對，獲得unigene 功能注釋信息。根據(jù)銀耳轉(zhuǎn)錄組unigene序列的KEGG注釋信息，對注釋信息進(jìn)行整理，分析銀耳多糖生物合成途徑，并對涉及相關(guān)unigene及對比信息進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

對2個(gè)銀耳樣本進(jìn)行測序文庫構(gòu)建，使用Qubit?2.0 Fluorometer 檢測濃度分別達(dá)到5.18和6.54 ng/μl，Agilent 2100檢測結(jié)果表明主峰長度分別為469和466 bp，表明構(gòu)建的銀耳測序文庫質(zhì)量合格，滿足上機(jī)測序要求。

使用Illumina HiSeq 2500 高通量測序平臺(tái)對每個(gè)樣品進(jìn)行測序，數(shù)據(jù)預(yù)處理組裝后共得到17 008條unigene，總長度為24 663 446 bp。Unigene平均長度為1450 bp，最小長度為281 bp，最大長度為16 768 bp，GC含量為57.80 %。通過組裝序列長度分布可知(圖 1)，400～600 bp范圍分布的序列最多，數(shù)目為3126(18.38 %)；超過2 k的序列中，主要分布在2000～3000 bp，數(shù)目為2102(12.36 %)，并隨著長度增加而數(shù)量逐漸減少。本研究中測序得到的銀耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)N50達(dá)到2073，表明本研究中構(gòu)建的銀耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫質(zhì)量較高。

2.2 銀耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)功能注釋

基于UniProt數(shù)據(jù)庫，對獲得的銀耳轉(zhuǎn)錄組unigene序列進(jìn)行對比和注釋，13 006條序列注釋到已知數(shù)據(jù)庫中，占總序列的76.47 %。其中較強(qiáng)同源性(<1×10-45)的序列比例為67.52 %，中度同源性(1×10-5～1×10-45)的序列比例為32.48 %；相似度介于22.27 %～100 %，其中55.05 %的相似度大于60 %，表明測序結(jié)果與已知序列相似度較高。

基于COG分類注釋結(jié)果表明，10 152條unigene能夠注釋到COG數(shù)據(jù)庫中，涉及25種COG分類，其中注釋最多的5個(gè)分類為“Intracellular trafficking, secretion, vesicular transport”、“Signal transduction mechanisms”、“Cytoskeleton”、“General function prediction only”和“RNA processing and modification”?；贕O數(shù)據(jù)庫將unigene按照分子功能(molecular function)、細(xì)胞位置(cellular component)、生物過程(biological process)進(jìn)行分類(圖 2)，4781條unigene得到注釋，涉及分子功能序列4705條、細(xì)胞位置序列1971條、生物過程序列1173條，表明銀耳轉(zhuǎn)錄組序列中更多涉及分子功能。

圖1 組裝序列長度分布Fig.1 Unigene length distribution

2.3 銀耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)KEGG分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對銀耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明5671條序列獲得KEGG注釋，共映射到297條途徑。涉及unigene數(shù)目最多的五個(gè)途徑分別為：Metabolic pathways、Biosynthesis of secondary metabolites、Biosynthesis of antibiotics、Microbial metabolism in diverse environments、Biosynthesis of amino acids，對應(yīng)unigene數(shù)目為1442、650、486、407和257 (表 1)。

2.4 銀耳多糖合成途徑相關(guān)基因鑒定

研究表明銀耳多糖是銀耳的主要活性成分，是銀耳菌絲體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)之一。銀耳多糖種類較多，大多數(shù)以甘露糖為主鏈。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對果糖和甘露糖代謝通路進(jìn)行分析，其代謝途徑如圖3所示，共挖掘得到74條unigene序列，涉及21個(gè)酶(表 2)。其中，編碼L-iditol 2-dehydrogenase涉及的unigene數(shù)目最多，為15條；其次是編碼butanol dehydrogenase的unigene為10條；編碼phosphomannomutase、triosephosphate isomerase和fructose-2,6-bisphosphatase等7個(gè)酶涉及1個(gè)unigene。對銀耳果糖和甘露糖代謝途徑的研究，將有助于進(jìn)一步研究銀耳活性成分的形成機(jī)理。

圖2 轉(zhuǎn)錄組序列分類GO柱Fig.2 Histogram of GO classification of all unigenes

圖3 銀耳果糖和甘露糖代謝途徑Fig.3 The fructose and mannose metabolism pathway in Tremella fuciformis

表2 果糖和甘露糖代謝途徑相關(guān)的unigeneTable 2 Unigenes related to fructose and mannose metabolism pathway

3 討 論

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究進(jìn)入了全新的時(shí)代。轉(zhuǎn)錄組測序促進(jìn)了非模式物種及無參考基因組物種的分子生物學(xué)研究。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)是利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組分析的一種技術(shù)，其具有高靈敏度、重復(fù)性好和數(shù)字化等多種優(yōu)勢[10]。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展和配套分析軟件的不斷成熟，加之無需參考基因組數(shù)據(jù)，使得轉(zhuǎn)錄組測序得到廣泛使用[11-12]。對于短時(shí)間內(nèi)無法完成基因組測序的生物而言，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)極大地促進(jìn)了分子生物學(xué)的研究，為后續(xù)挖掘奠定了理論基礎(chǔ)。 在食用菌方面，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)應(yīng)用于食用菌發(fā)育相關(guān)基因挖掘，活性物質(zhì)的調(diào)控解析，以及分子標(biāo)記開發(fā)等方面。Huang等[13]對桑黃(Phellinuslinteus)的菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，組裝后獲得25 811個(gè)Unigene，并對與桑黃甾醇的生物合成相關(guān)基因和SSR分子標(biāo)記等進(jìn)行挖掘；Shu等[14]對茯苓(Wolfiporiacocos)的菌絲體和菌核分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，基于獲得unigene序列進(jìn)行萜類代謝途徑解析，發(fā)現(xiàn)在茯苓中萜類化合物的生物合成只能通過MVA途徑。Lu等[15]對牛樟芝(Antrodiacinnamomea)進(jìn)行基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，并對菌絲體和子實(shí)體差異表達(dá)基因等進(jìn)行分析，挖掘得到了萜類生物合成等關(guān)鍵產(chǎn)物的代謝途徑。聶文強(qiáng)等[16]對藥食兩用真菌灰樹花(Grifolafrondosa)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，挖掘得到了115條unigene與多糖合成相關(guān)，以及1155個(gè)SSR位點(diǎn)，為灰樹花及同屬物種的遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因挖掘奠定了基礎(chǔ)。Tang等[17]對香菇轉(zhuǎn)錄組和蛋白組進(jìn)行分析，研究了光誘導(dǎo)對香菇菌絲轉(zhuǎn)色的形成機(jī)制，揭示出與香菇菌絲轉(zhuǎn)色的候選基因，并初步建立了其分子模型。轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食用菌代謝通路和關(guān)鍵調(diào)控基因解析，并促進(jìn)了分子標(biāo)記開發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建?；谏鲜鲅芯浚疚囊糟y耳為研究對象，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對銀耳轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行構(gòu)建和分析。

本研究運(yùn)用Illumina測序平臺(tái)對銀耳菌絲體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，組裝得到17 008條unigene序列。與其它食用菌相比，銀耳轉(zhuǎn)錄組測序得到序列數(shù)量多于白蟻蘑菇、雙孢蘑菇等[18]，少于靈芝、桑黃和茯苓等食用菌[13]，這可能與物種本身特性和取材等因素有關(guān)。對于unigene長度而言，本研究得到unigene的平均長度和N50值為1450和 2073 bp，遠(yuǎn)高于靈芝、桑黃、白蟻蘑菇和茯苓等，表明銀耳轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果質(zhì)量較高，為深入開展銀耳品質(zhì)形成機(jī)理提供了豐富的數(shù)據(jù)資源?；阢y耳轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對果糖和甘露糖代謝途徑相關(guān)基因，分析得到74條unigene，編碼21個(gè)酶；其中編碼L-iditol 2-dehydrogenase的unigene最多，其次是butanol dehydrogenase。與其他物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析相比，銀耳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘得到的果糖和甘露糖代謝相關(guān)基因較少；但涉及果糖和甘露糖代謝的酶數(shù)目與其他研究基本一致。上述結(jié)果表明，銀耳中果糖和甘露糖代謝途徑的調(diào)控過程涉及常見酶，調(diào)控過程相對復(fù)雜[19]。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對銀耳進(jìn)行測序分析，獲得大量轉(zhuǎn)錄本信息，從分子機(jī)制水平上揭示關(guān)鍵成分的分子機(jī)制，將有助于銀耳品種培育和生長調(diào)節(jié)，促進(jìn)銀耳產(chǎn)量和品質(zhì)。

4 結(jié) 論

本研究采用Illumina測序平臺(tái)對銀耳菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到大量的轉(zhuǎn)錄組序列信息，并對序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)解析。從銀耳菌絲體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共得到了17 008條unigene序列，其中N50為2073 bp。其中，76.47 %序列能夠注釋到Uniprot公共數(shù)據(jù)庫；共有74條unigene序列涉及銀耳果糖和甘露糖代謝途徑。對銀耳轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序和分析，有助于深入開展銀耳多糖合成機(jī)理和品質(zhì)提升研究，為進(jìn)一步提升銀耳品質(zhì)和產(chǎn)量奠定了理論基礎(chǔ)。銀耳形成復(fù)雜，涉及與香灰菌的互作，其互作過程對銀耳多糖形成機(jī)理仍有待深入研究。