鱗柄小奧德蘑多糖對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞抑制結(jié)直腸腺癌細(xì)胞生長的影響

張紹楠，劉紫征，趙 敏，喬 潔,3，閆訓(xùn)友,3，王 晶,3*

(1.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011；3. 河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 廊坊 065000 )

【研究意義】鱗柄小奧德蘑(Oudemansiellafurfuracea)，歸屬蘑菇目(Agaricales)膨瑚菌科(physalacriaceae)狹義小奧德蘑屬(Oudemansiella)[1]，其口味鮮美，富含多種營養(yǎng)成分[2]，具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值，主要種植于北京、河北和山東等地區(qū)。目前對該菌的研究主要集中在栽培和生物活性的提取等方面[2-3]，未見鱗柄小奧德蘑多糖生物學(xué)活性的研究報道?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】真菌多糖是食藥用真菌活性物質(zhì)之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，真菌多糖可通過激活巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力和抗腫瘤[4-8]。如香菇多糖(國藥準(zhǔn)字Z20080579)、靈芝多糖(國藥準(zhǔn)字Z36021232)、銀耳多糖(國藥準(zhǔn)字Z22023305)和茯苓多糖(國藥準(zhǔn)字B20050015)[9]可作為免疫調(diào)節(jié)劑，與抗腫瘤化療藥物聯(lián)用，增強(qiáng)療效；阿魏側(cè)耳胞外多糖可通過提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性和血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)含量等增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，降低荷瘤小鼠實體瘤的重量[10-11]，因此，真菌多糖是極具開發(fā)價值的功能性物質(zhì)，它逐漸成為新藥、功能保健品、綠色食品添加劑[12]和臨床應(yīng)用中極具潛力的發(fā)展方向?！颈狙芯壳腥朦c】本文利用巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，以四甲基偶氮唑藍(lán)法(methylthiazoletrazolium，MTT)測定存活的結(jié)直腸腺癌細(xì)胞數(shù)量為指標(biāo)，研究鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞抑制結(jié)直腸腺癌細(xì)胞生長的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過測定巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和NO的合成與分泌量、TNF-α和白細(xì)胞介素-1(interleukin 1, IL-1)分泌量，初步探究相關(guān)細(xì)胞和分子機(jī)制，為鱗柄小奧德蘑多糖的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料：鱗柄小奧德蘑，購自廊坊市，采用ITS序列分析鑒定[13]后備用；結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2和巨噬細(xì)胞NR8383購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，保存于本實驗室內(nèi)液氮罐中。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

試驗試劑：F12K培養(yǎng)基和脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)美國Sigma公司；DMEM/F12和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)美國Gibco公司；NO熒光探針(4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate，DAF-FM DA)、NO檢測試劑盒和雙辛丁酸法(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司； TNF-α、IL-1β和iNOS ELISA檢測試劑盒青島海德誠生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)和MD44透析袋北京索萊寶科技有限公司；實驗所需其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

試驗儀器：MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱和MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋日本SANYO公司；iMark酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國Millipore公司；BX50系統(tǒng)顯微鏡(配有CCD圖像傳感器(DP71)及Image-pro plus 圖像分析軟件)和CKX41SF倒置顯微鏡日本Olympus公司；ZHJH-C超凈工作臺上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多糖提取 采用熱水浸提法[13]。將鱗柄小奧德蘑子實體自然干燥，用組織粉碎機(jī)粉碎為干粉，乙醇除脂[14]，低溫干燥后，熱水浸提，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，Sevag法除蛋白，透析袋透析(截留分子量3.5 kD)，冷凍干燥后得鱗柄小奧德蘑多糖(polysaccharides fromOudemansiellafurfuracea,OFPS)[13]，將其溶解于F12K培養(yǎng)液(含15 % FBS)，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，置于4 ℃冷藏備用。

1.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇參考倪黎綱等[15]方法，并改進(jìn)。從液氮中取出細(xì)胞凍存管，置于40 ℃水浴融化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管中，離心后棄上層液體，用含20 % FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種至底面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 巨噬細(xì)胞采用培養(yǎng)瓶懸浮法培養(yǎng)，離心法傳代。收集細(xì)胞懸液，1500 r/min離心10 min，棄上層液體，加入重懸細(xì)胞，分別接種于2個培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液至5 mL。

結(jié)直腸腺癌細(xì)胞采用培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)，胰蛋白酶消化法傳代。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合率達(dá)80 %～90 %，用D-Hanks漂洗1次，胰蛋白酶-EDTA消化，加入含10 % FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液，吹打分散，分別接種于兩個培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液至5 mL/瓶，37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.4 細(xì)胞接種 參考王晶等[11]方法。離心收集巨噬細(xì)胞或者結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/mL，接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 ℃，含5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞與結(jié)直腸腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立：按上述方法收集接種結(jié)直腸腺癌細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種密度為2×108個/L，37 ℃，含5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄上層培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，加入200 μl巨噬細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×109個/L[16]，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10 % FBS的DMEM/F-12，培養(yǎng)條件為37 ℃，5 % CO2，恒溫。

1.3.5 多糖處理 在上述細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加鱗柄小奧德蘑多糖處理，設(shè)空白對照組、陽性對照組和多糖處理組?？瞻讓φ战M添加完全培養(yǎng)液，陽性對照組添加終濃度為20 mg/L的LPS，多糖處理組分別添加終濃度為25、50、100和200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖，每組設(shè)10個重復(fù)。

1.3.6 細(xì)胞存活率檢測 采用MTT法[17]。多糖處理后，添加5 g/L的MTT母液處理4 h。巨噬細(xì)胞：將細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞懸液收集至離心管中，1500 r/min離心10 min，棄上層液體，緩沖溶液D-Hanks漂洗1次，再次離心，每個離心管中加入150 μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩混勻后轉(zhuǎn)置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，酶標(biāo)儀檢測OD490。單獨培養(yǎng)或共培養(yǎng)的結(jié)直腸腺癌細(xì)胞：吸棄96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中上層液體或巨噬細(xì)胞懸液，D-Hanks漂洗2遍，每孔加入150 μl DMSO，震蕩混勻，酶標(biāo)儀檢測A90。

1.3.7 巨噬細(xì)胞NO含量測定 細(xì)胞內(nèi)NO檢測采用熒光探針法[11]。按上述方法接種巨噬細(xì)胞并用鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h，離心后收集培養(yǎng)上清，備用；細(xì)胞沉淀中加入稀釋后DAF-FM DA熒光探針(探針∶稀釋液=1∶300)，37 ℃避光孵育30 min，D-Hanks洗滌細(xì)胞3次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA，后用D-Hanks重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)至載玻片，加蓋蓋玻片后用熒光顯微鏡觀察拍照，Image-ProPlus軟件測定光密度值。

細(xì)胞外NO分泌量檢測采用Griess法[11]。將試劑盒中Griess Reagent I和II，室溫放置30 min回溫，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入50 μl標(biāo)準(zhǔn)品或各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清、50 μl Griess Reagent I和50 μl Griess Reagent II。NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 μmol/L。每組設(shè)3個重復(fù)。酶標(biāo)儀測定A540nm，并根據(jù)NaNO2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各培養(yǎng)上清中NO濃度。

1.3.8 iNOS測定 按上述方法接種巨噬細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種量為5 mL。多糖處理24 h后，離心，細(xì)胞沉淀用PBS重懸，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎[11]，離心，收集上清，按照試劑盒說明，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗測定巨噬細(xì)胞中iNOS含量[11]。

酶聯(lián)免疫吸附實驗采用雙抗體一步夾心法[11]。按照試劑盒說明，在室溫平衡后酶標(biāo)板的板條中依次加入50 μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或者10 μl待測樣品(補(bǔ)加40 μl樣品稀釋液)、100 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體(空白孔除外)，37 ℃溫育30 min。棄液體，甩干，多次洗滌甩干后，每孔加入底物A、B各50 μl，避光孵育，終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測A450 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中iNOS濃度。

1.3.9 TNF-α、IL-1β分泌量的測定 采用雙抗體一步夾心法[11]。取上述離心后的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒的說明操作 (方法同1.2.8)，根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α和IL-1β濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)

復(fù)蘇后的巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞在實驗培養(yǎng)體系中均可正常的生長和增殖。其中，巨噬細(xì)胞(圖 1A)在含10 % FBS的F12K培養(yǎng)基中懸浮或半懸浮生長，呈圓形，細(xì)胞透光性較好，細(xì)胞生長較緩慢，10～15 d傳代1次。人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(圖1B)在含10 % FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中則貼壁生長，呈上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞連接緊密，生長迅速，5～7 d可傳代1次。兩細(xì)胞共同培養(yǎng)時(圖 1C)，巨噬細(xì)胞懸浮于上層培養(yǎng)液中，細(xì)胞透光性較好，細(xì)胞較結(jié)直腸癌腺細(xì)胞分裂相小，且部分細(xì)胞有輕微聚集現(xiàn)象；結(jié)直腸腺癌細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶底部，細(xì)胞質(zhì)中有較多空泡，細(xì)胞狀態(tài)較差。

A, 巨噬細(xì)胞NR8383 (100×); B, 結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2 (100×)；C, 共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(200×),“→” 示巨噬細(xì)胞, “#” 示結(jié)直腸腺癌細(xì)胞內(nèi)空泡A, NR8383 (100×); B, Caco-2 (100×)；C, Co-cultured NR8383 and Caco-2 (200×)，‘→’: NR8383，‘#’: Cytoplasmic vacuoles in Caco-2圖1 體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Fig.1 Cultured alveolar macrophage and colorectal adenocarcinoma in vitro

表1 鱗柄小奧德蘑多糖對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞存活的影響Table 1 Effect of OFPS on the survival of colorectal adenocarcinomas and alveolar macrophages in vitro

注：“*”與空白對照組相比，顯著差異(P<0.05)，下同。

2.2 2鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞存活的影響

由表1可知，25～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖處理24和 48 h，巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著高于對照組(P< 0.05)，而結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的數(shù)量與對照組無顯著性差異，說明鱗柄小奧德蘑多糖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，但對結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的生長無顯著性影響。

根據(jù)上述實驗結(jié)果，結(jié)合體外培養(yǎng)的結(jié)直腸腺癌細(xì)胞貼壁生長和巨噬細(xì)胞懸浮生長的特點，研究者建立了2種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，對該體系實施輕微震蕩和磷酸鹽緩沖溶液漂洗處理，即可去除其中懸浮生長的巨噬細(xì)胞，之后采用MTT法測定的共培養(yǎng)體系的細(xì)胞存活率應(yīng)為結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的存活率。由表1可知，與獨立培養(yǎng)的結(jié)直腸腺癌細(xì)胞相比，接種巨噬細(xì)胞24和48 h后，共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的存活率顯著降低(P< 0.05)。與共培養(yǎng)對照組相比，100～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖處理24和48 h，共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的存活率顯著降低(P< 0.05)，25～50 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理24和 48 h對培養(yǎng)體系中結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的存活率無顯著性影響。由于鱗柄小奧德蘑多糖處理24和48 h均未引起體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞或結(jié)直腸腺癌細(xì)胞存活率的下降，故推測，共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞對結(jié)直腸腺癌細(xì)胞具有一定的殺傷作用；鱗柄小奧德蘑多糖處理后，共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸腺癌細(xì)胞存活率顯著下降，可能是由于巨噬細(xì)胞對其殺傷作用被增強(qiáng)所致。

2.3 鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞NO合成和分泌的影響

巨噬細(xì)胞幾乎分布于全身各組織[18]，主要由血液中的單核細(xì)胞穿出血管到達(dá)結(jié)締組織后分化而來。在LPS和白細(xì)胞介素4/13(interleukin 4/13, IL-4/13)刺激下，巨噬細(xì)胞可分別極化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage，M1型)[19]和替代性活化巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage，M2型)[20-21]。其中，M1型巨噬細(xì)胞分泌IL-1和TNF-α等信號分子[22]，表達(dá)iNOS并以精氨酸為底物產(chǎn)生NO和活性氮[23]，從而抑制病原菌的增殖[22]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]、殺死癌細(xì)胞[ 18]和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力[25]；M2型巨噬細(xì)胞則表達(dá)精氨酸酶-1產(chǎn)生鳥氨酸和尿素[24]，并分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血小板源生長因子、腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor-β, TNF-β)和IL-10(interleukin 10, IL-10)等細(xì)胞因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗炎和組織修復(fù)功能[18]。由此可見，NO是M1型巨噬細(xì)胞發(fā)生攻擊反應(yīng)時的獨特分子[18]。

DAF-FM DA最新一代NO熒光探針是可穿過質(zhì)膜，并被細(xì)胞質(zhì)中的非特異性酯酶切割乙酸基，形成DAF-FM。DAF-FM不能穿過質(zhì)膜，有很弱的熒光，但與NO反應(yīng)后形成苯并三氮唑，后者能產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光[26]。跨質(zhì)膜擴(kuò)散到細(xì)胞外的NO極不穩(wěn)定，容易被氧化生成NO3-和NO2-，NO2-可采用Griess Reagent方法檢測，在一定程度上代表細(xì)胞產(chǎn)生的NO的相對量[12]。

由圖2～3可知， 25 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理組巨噬細(xì)胞中NO探針的熒光較弱，平均光密度較低，與對照組無顯著性差異；而50～200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)NO探針的熒光強(qiáng)度和平均光密度顯著增強(qiáng)(P< 0.05)，且具有濃度依賴性。由表2可知，50～200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理巨噬細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)iNOS濃度和細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO濃度顯著增加(P< 0.05)，與細(xì)胞內(nèi)NO探針的平均光密度結(jié)果一致，說明50～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖促進(jìn)了巨噬細(xì)胞中iNOS表達(dá)和NO合成，進(jìn)而抑制共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的生長。

A.空白對照組；B.20 mg/L LPS處理組; C～F.25,50,100,200 mg/L鱗柄小奧德蘑多糖處理組A.Control;B.Treated with 20 mg/L LPS; C-F.Treated with 25,50,100,200 mg/L OFPS圖2 NO熒光探針標(biāo)記的巨噬細(xì)胞(200×)Fig.2 Alveolar macrophages labeled by DAF-FM DA

“* ”，表示與對照組相比，差異顯著(P < 0.05)圖3 巨噬細(xì)胞中NO探針熒光的平均光密度值Fig.3 Mean optical density of fluorescence for NO probe in alveolar macrophages

2.4 鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-1β分泌量的影響

NR8383細(xì)胞系來源于肺灌洗時的正常大鼠巨噬細(xì)胞[27]，具有吞噬酵母多糖，表達(dá)iNOS和分泌IL-1和TNF-α等信號分子能力[28 ]。采用雙抗體夾心法進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實驗的結(jié)果顯示，25～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖處理24 h，可顯著提高巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌量(P<0.05，表2)；25～200 mg/L的鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌量無顯著性影響(表2)。

3 討 論

為研究鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞抑制癌細(xì)胞生長的影響，本實驗選擇巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞和消化道癌細(xì)胞——結(jié)直腸腺癌細(xì)胞作為實驗細(xì)胞，其中NR8383細(xì)胞具有吞噬功能，并可分泌多種細(xì)胞因子。研究者在2種細(xì)胞的體外獨立培養(yǎng)體系和共培養(yǎng)體系中添加不同濃度的鱗柄小奧德蘑多糖，采用MTT法測定了獨立培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活率。研究發(fā)現(xiàn)，鱗柄小奧德蘑多糖對獨立培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞生長無顯著性影響，但可引起共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸癌細(xì)胞存活率的顯著下降。

研究表明，NO是M1型巨噬細(xì)胞發(fā)生攻擊反應(yīng)時合成和分泌的信號分子[18]，TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的一種多效細(xì)胞因子，具有殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和提高中性粒細(xì)胞吞噬活性等功效[10]。IL-1β是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一類調(diào)控免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]。本實驗采用熒光探針標(biāo)記和酶聯(lián)免疫實驗等方法測定的共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞NO和合成與分泌量以及培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β含量結(jié)果表明，一定添加濃度的鱗柄小奧德蘑多糖處理顯著提高了巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌量，但對IL-1β含量無顯著性影響。由此推測，一定添加濃度的鱗柄小奧德蘑多糖可能通過增加巨噬細(xì)胞對NO和TNF-α的分泌量，進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺傷癌細(xì)胞的能力，降低了共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的數(shù)量。

表2 鱗柄小奧德蘑多糖對巨噬細(xì)胞NO、iNOS和細(xì)胞因子分泌量的影響Table 2 Effects of OFPS on NO, iNOS and cytokines’ secretion of cultured alveolar macrophages in vitro

4 結(jié) 論

利用巨噬細(xì)胞和結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的不同生長特性，建立了兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，并利用此體系，研究鱗柄小奧德蘑多糖對共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞抑制結(jié)直腸腺癌細(xì)胞生長的影響。根據(jù)存活細(xì)胞數(shù)量、熒光探針標(biāo)記和酶聯(lián)免疫吸附試驗等測定結(jié)果可知，添加一定濃度的鱗柄小奧德蘑多糖可顯著降低共培養(yǎng)體系中結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的數(shù)量，而這種作用可能是鱗柄小奧德蘑多糖通過提高細(xì)胞對iNOS、NO和TNF-α等合成或分泌量，進(jìn)而抑制結(jié)直腸腺癌細(xì)胞生長和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺傷能力。