積雪苷軟膏對BALB/C裸小鼠瘢痕疙瘩模型成纖維細(xì)胞及膠原蛋白表達(dá)的影響

楊 艷 郭桂珍 王衛(wèi)濤 馬春鋒

瘢痕疙瘩(keloid)最顯著的病理特征是成纖維細(xì)胞持續(xù)活化所產(chǎn)生的高水平的膠原、纖連蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分，尤其是膠原的過度堆積，從而導(dǎo)致真皮的持久纖維化[1]。積雪苷是萃取于天然藥用植物積雪草的有效成分，因其具有抗炎作用，能抑制瘢痕形成而考慮將其用于瘢痕疙瘩的治療，前期我們已經(jīng)在細(xì)胞水平證實(shí)積雪苷能抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并下調(diào)結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)[2],現(xiàn)在我們建立了瘢痕疙瘩裸鼠模型,在穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中觀察外用積雪苷軟膏對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞及其膠原蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本來源 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/C品系裸小鼠，SPF級，6～8周齡，共16只，雌雄不限，每只重20～23 g，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。瘢痕疙瘩標(biāo)本來源于城陽人民醫(yī)院皮膚科瘢痕疙瘩患者(經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書)，手術(shù)取材于前胸部及肩部瘢痕組織?；颊吣挲g16～45歲，平均(30.53±7.19)歲。瘢痕疙瘩的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1992年Darzi診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。入選標(biāo)準(zhǔn)：2年內(nèi)未接受藥物注射、放療或外科治療，無系統(tǒng)疾病者。

1.2 主要試劑及儀器 積雪苷軟膏由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供(濃度為0.00125%、0.0025%、0.005%)，兔抗人I型膠原多克隆抗體，克隆號(hào)BA0325(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，PV-9000非生物素通用型二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，LAB VISION自動(dòng)免疫組化染色儀，透射電子顯微鏡(JEM-1230，JEOL Inc公司，Japan)。

1.3 建立動(dòng)物模型及分組治療 取6～8周齡,體重20～23 g/只,BALB/C裸小鼠,將外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織立即在無菌條件下切成8 mm×5 mm×5 mm大，植入裸鼠兩側(cè)肩胛部各一塊及骶尾部一塊。兩周后，組織塊存活，無感染及排斥現(xiàn)象，將16只瘢痕疙瘩裸小鼠隨機(jī)分為四組，A組外用對照軟膏基質(zhì)，B組外用0.00125%積雪苷軟膏，C組外用0.0025%積雪苷軟膏，D組外用0.005%積雪苷軟膏，屏障環(huán)境無菌條件下以棉簽蘸藥膏，順時(shí)針方向均勻涂抹，每日三次，同時(shí)觀察局部皮膚反應(yīng)、組織變化、裸小鼠的全身情況。

1.4 組織病理檢查 用藥后6周取出所有植入的瘢痕疙瘩組織塊，觀察組織塊形態(tài)，測量其體積，將之切分為兩半，送透射電鏡檢查；送常規(guī)病理。

1.5 I型膠原蛋白免疫組化 采用LAB VISION 2D全自動(dòng)免疫組化染色儀，ELIVISON二步法進(jìn)行染色。從自動(dòng)免疫組化染色儀中取出已染色完畢的切片，蘇木素復(fù)染，0.1%HCL分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥二甲苯透明，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗處理的切片作為空白對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。結(jié)果判定：I型膠原的免疫組織化學(xué)評分采用半定量判斷指標(biāo)：每組24張切片，顯微鏡下，每張切片選擇染色良好區(qū)域觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野，由兩位病理診斷醫(yī)生雙盲判讀。高表達(dá)率切片呈棕黃色或棕褐色。根據(jù)膠原纖維著色面積及陽性染色強(qiáng)弱進(jìn)行判斷。著色強(qiáng)弱計(jì)分：未著色計(jì)分為0，淡黃色計(jì)分為1，棕黃色或棕褐色計(jì)分為2；著色面積計(jì)分：著色面積在10%以下計(jì)分為0，陽性面積在10%～25%計(jì)分為1，陽性面積在26%～50%計(jì)分為2，陽性面積在50%以上且著色較深計(jì)分為3。上述兩項(xiàng)相加，≤1為陰性(-)，2為弱陽性(+)，3為中等陽性(++)，≥4為強(qiáng)陽性(+++)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以α=0.05為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用Stata7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher精確概率法計(jì)算。

1.6 透射電鏡檢查 將已修成1 mm3的瘢痕疙瘩組織塊置預(yù)冷的4%戊二醛固定液中，固定2 h；在4℃下進(jìn)行梯度脫水, 將脫水后樣品進(jìn)行浸透、包埋, 顯微鏡下用手術(shù)刀片修塊；組織切片機(jī)上先切取數(shù)張2 μm厚的半薄切片，1% 甲苯胺藍(lán)溶液染色，光鏡下觀察定位后在超薄切片機(jī)上超薄切片，厚度為70 nm左右，讓其貼附在有支持膜的銅網(wǎng)上，檸檬酸鈉-硝酸鉛復(fù)染10 min，JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察 各組裸小鼠均存活，生活狀態(tài)良好，飲食、大小便、體重增長、活動(dòng)均正常。A組(對照組)用藥至第六周時(shí)局部皮膚完好，組織塊大小、硬度無明顯變化；B組(0.00125%濃度組)用藥兩周后局部皮膚稍紅,但無靡爛、破潰，繼續(xù)用藥后皮膚又恢復(fù)正常，用藥至第六周時(shí)組織塊平均體積稍縮小，質(zhì)地中等；C組(0.0025%濃度組)用藥兩周后局部皮膚稍紅，繼續(xù)用藥時(shí)可見小鼠抓撓用藥處，三周時(shí)用藥局部出現(xiàn)點(diǎn)狀表皮缺損，組織塊完好，繼續(xù)用藥至第六周時(shí)局部點(diǎn)狀表皮缺損愈合，組織塊平均體積縮小，表現(xiàn)為厚度變薄，3.5～4 mm，質(zhì)地中至軟；D組(0.005%濃度組)用藥兩周后局部皮膚稍紅，繼續(xù)用藥時(shí)可見小鼠抓撓用藥處，三周時(shí)用藥局部出現(xiàn)點(diǎn)狀表皮缺損，組織塊完好，繼續(xù)用藥至第六周時(shí)局部點(diǎn)狀表皮缺損未愈，組織塊平均體積縮小，表現(xiàn)為厚度明顯變薄，3～3.5 mm，質(zhì)地中至軟。見圖1～6。

圖1植入前的瘢痕疙瘩組織塊圖2A組6 w時(shí)組織塊外觀圖3B組用藥至6 w時(shí)組織塊外觀圖4C組用藥至3 w后局部出現(xiàn)點(diǎn)狀表皮缺損，6 w后愈合圖5D組用藥6 w時(shí)取組織塊圖6C組用藥后組織塊體積縮小

2.2 光鏡觀察 用藥6周后取瘢痕疙瘩組織塊，常規(guī)HE染色，光鏡下A組組織結(jié)構(gòu)與移植前相似，可見成纖維細(xì)胞數(shù)較多，膠原纖維粗大，排列紊亂，邊緣可見較多微血管；B組、C組、D組均可見成纖維細(xì)胞數(shù)明顯減少，組織塊邊緣膠原纖維變細(xì)呈波浪狀，排列整齊，部分中央膠原纖維仍粗大，呈結(jié)節(jié)、漩渦狀，組織塊邊緣處有少量炎癥細(xì)胞浸潤。變化以C、D組為明顯。見圖7、8。

2.3 I型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色 染色結(jié)果(-)、(+)設(shè)為低表達(dá)，(++)、(+++)為高表達(dá)。檢測結(jié)果應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher精確概率法計(jì)算。見圖9～12。I型膠原表達(dá)情況見表1、2。外用積雪苷軟膏后，B組、C組、D組總膠原高表達(dá)的陽性率分別為70.83%、37.50%、33.33%，對照組A組總膠原高表達(dá)的陽性率為79.17%，實(shí)驗(yàn)組膠原高表達(dá)的陽性率明顯降低，四組率比較，F(xiàn)isher精確概率檢驗(yàn)法計(jì)算(P=0.001)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再進(jìn)行四組率的兩兩比較，應(yīng)用Scheffé可信區(qū)間法，A組與B組比較，95%可信區(qū)間為(-0.2643～0.4311)，可信區(qū)間包含0，此兩組間的差異無顯著性；A組與C組比較，95%可信區(qū)間為(0.0562～0.7772)，可信區(qū)間不包含0，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組與D組比較，95%可信區(qū)間為(0.1035～0.8133)，可信區(qū)間不包含0，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組與C組比較，95%可信區(qū)間為(-0.0455～0.7121)，可信區(qū)間包含0，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組與D組比較，95%可信區(qū)間為(0.0015～0.7465)，可信區(qū)間不包含0，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C組與D組比較，95%可信區(qū)間為(-0.3438～0.4272)，可信區(qū)間包含0，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 I型膠原蛋白陽性表達(dá)數(shù)列表

表2 I型膠原蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)表

2.4 透射電鏡觀察 透射電鏡觀察顯示：A組成纖維細(xì)胞數(shù)量仍多，細(xì)胞核膜清晰，核仁明顯，有較豐富的細(xì)胞器，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中等，核糖體和高爾基器豐富，膠原豐富，排列紊亂。B、C、D組成纖維細(xì)胞明顯減少，可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核固縮，膜結(jié)構(gòu)不清，有壞死的細(xì)胞碎片及裸核狀態(tài)的成纖維細(xì)胞。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，呈囊泡狀，線粒體空泡變，膠原纖維溶解，可見細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外凋亡小體的產(chǎn)生。此變化以C、D組較明顯。見圖13、14。

圖7C組用藥6 w后見成纖維細(xì)胞數(shù)明顯減少，邊緣膠原纖維排列整齊、疏松、趨于正常真皮結(jié)構(gòu)(HE,×100)圖8對照基質(zhì)外用6 w后見成纖維細(xì)胞數(shù)較多，膠原纖維粗大、排列紊亂(HE,×100)圖9A組，I型膠原表達(dá)(免疫組化,×100)

圖10B組I型膠原表達(dá)(免疫組化，×100)

圖11C組I型膠原表達(dá)(免疫組化,×100)圖12D組I型膠原表達(dá)(免疫組化,×100)圖13C組6 w后透射電鏡下見成纖維細(xì)胞核固縮，膜結(jié)構(gòu)不清，膠原纖維溶解(標(biāo)尺為1 μm)圖14A組6 w后透射電鏡下見成纖維細(xì)胞內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體(標(biāo)尺為1 μm)

3 討論

瘢痕疙瘩是一種臨床上常見的纖維增生性疾病，是以皮膚受創(chuàng)傷后真皮異常纖維增生反應(yīng)為特征的病理性組織。其形成機(jī)制尚未明了，近年來越來越多的學(xué)者傾向于認(rèn)為瘢痕疙瘩是一種良性的皮膚腫瘤[4]，目前臨床上一般主張應(yīng)用綜合療法，多采用手術(shù)切除聯(lián)合糖皮質(zhì)激素注射、壓力療法、硅膠片敷貼、術(shù)后淺層放療等進(jìn)行綜合治療[5]。但上述療法或存在一定的創(chuàng)傷性，或應(yīng)用不便，或費(fèi)用較高，而且不能完全抑制瘢痕疙瘩的復(fù)發(fā)。在此基礎(chǔ)上，人們一直在尋找更為方便、安全、有效的治療方法來輔助治療，降低復(fù)發(fā)率。積雪苷能抑制成纖維母細(xì)胞增殖，降低轉(zhuǎn)酰氨基酶活化，減少酸性黏多糖和膠原量，使結(jié)締組織的基質(zhì)和纖維成份的過度增生受到控制，對無秩序的瘢痕疙瘩增生具有抑制和緩解作用[6]；而且積雪苷通過抑制瘢痕的Smad通路使成纖維細(xì)胞增殖受阻改變成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) ,促進(jìn)其凋亡[7]，積雪苷還可以通過降低TGF-β1達(dá)到促進(jìn)一型膠原降解，減輕瘢痕增生的作用[8]。前期我們已經(jīng)證實(shí)在體外細(xì)胞水平上積雪苷能抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并下調(diào)CTGF的表達(dá)，且還與積雪苷作用濃度存在一定的依賴性，本實(shí)驗(yàn)從裸鼠瘢痕疙瘩模型中證實(shí)外用積雪苷軟膏能減少瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞并下調(diào)I型膠原蛋白的表達(dá),為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。