血清miR-133a 、miR-150在心房顫動患者中的表達水平及臨床意義

孫杰，佟子川，郭麗敏，唐學(xué)弘

心房顫動（AF，房顫），是臨床中常見的 心律失常。房顫發(fā)生時，心房收縮和舒張能力異常，導(dǎo)致心臟泵血功能受損，血流瘀滯，易形成血栓栓塞、心力衰竭等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者健康[1,2]。由于我國人口老齡化的加劇，房顫患者人數(shù)不斷上升。目前，房顫的療效并不理想，預(yù)防和治療房顫一直是心血管疾病研究的熱點。microRNAs（miRNAs）是一類高度保守的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，參與細胞生長、分化、凋亡等生物學(xué)過程。多種miRNA通過參與心肌電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。Soeki等[3]研究發(fā)現(xiàn)房產(chǎn)患者血清miR-328水平升高，其與與左心房電壓區(qū)指數(shù)呈正相關(guān)，左心房局部產(chǎn)生miR-328可能參與房顫患者的心房重構(gòu)過程。李菲等[4]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者血清miR-101表達下調(diào)，其可能通過上調(diào)L型鈣通道β2和鈉鈣交換體（NCX）誘發(fā)或促進房顫發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a在心肌中特異性表達，參與調(diào)節(jié)心肌細胞分化、增殖[5]。miR-150表達與心肌重構(gòu)、心肌纖維化等密切相關(guān)[6]。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測房顫患者血清miR-133a和miR-150表達水平，分析其臨床意義，為房顫的臨床診斷標(biāo)記物的選擇和該疾病的治療尋找新的突破口。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2015年1月至2016年12月于首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的73例房顫患者為研究對象，其中男性41例，女性32例，年齡39～86歲，平均年齡（59.43±8.71）。依據(jù)2014年《美國心房顫動治療指南》將73例房顫患者分為陣發(fā)性房顫21例、持續(xù)性房顫28例、永久性房顫24例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤患者；②合并自身免疫疾病患者；③合并腎功能不全患者；④臨床資料完整者。另選取25例健康志愿者為對照組，其中男性14例，女性11例，年齡35～85歲，平均年齡（58.27±8.69）歲。所有受試者均自愿簽署知情同意書。

1.2 實驗試劑和儀器RNA提取試劑盒，美國Invitrogen公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，日本Takara公司；引物由金斯瑞生物科技公司設(shè)計提供。AU5800全自動生化分析儀，貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；Nano-400超微量核酸儀，杭州奧盛儀器有限公司；LightCycler?96實時熒光定量PCR儀，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 血樣采集采集所有受試者清晨空腹靜脈血，置于抗凝管中，4℃、3500 r/min離心10 min，收集上清液-20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)心臟彩超檢查獲取受試者左心房內(nèi)徑（LAD）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.4 實驗室指標(biāo)檢測運用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇 （HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。試劑盒檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）。

1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測血清miR-133a和miR-150水平采用試劑盒提取血清中總RNA，微量核酸儀檢測RNA濃度和純度。在260nm和280nm處吸光值的比值大于1.8時可用于擴增。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板進行擴增。內(nèi)參U6上游引物5'-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGC-3'，下游引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCT-3'；miR-133a上游引物5'-CAAGCTGGTAAAAATGGA

A-3'；下游引物5'-TATGGTTTTGACGACTGT GTAT-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，總共進行45個循環(huán)，72℃延伸10 min。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-133a和miR-150的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗。計數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較對照組和房顫患者在年齡、性別、吸煙史、飲酒史、TC、TG、HDL-C、收縮壓、舒張壓比較無顯著差異（P＞0.05）。與對照組比，房顫患者LDL-C、hs-CRP、左心房內(nèi)徑和MMP-9水平顯著升高（P＜0.05），LVEF水平顯著降低（P＜0.05）。不同類型房顫患者之間比較，LDL-C、hs-CRP、LAD、LVEF、MMP-9差異也顯著（P＜0.05）（表1～2）。

2.2 對照組和房顫患者血清miR-133a和miR-150比較與對照組比，房顫患者血清miR-133a水平顯著升高（P＜0.05），miR-150水平顯著降低（P＜0.05）（表3）。

表1 對照組和房顫患者一般資料比較

表2 不同類型房顫患者一般資料比較

2.3 不同類型房顫患者血清miR-133a和miR-150比較陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫三組miR-133a水平依次升高，miR-150水平依次降低。三組間miR-133a和miR-150兩兩比較，差異均顯著（P＜0.05）（表4）。

2.4 房顫患者血清miR-133a和miR-150與各檢測指標(biāo)相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，房顫患者血清miR-133a與hs-CRP、左心房內(nèi)徑、MMP-9呈正相關(guān)（P＜0.05），與LVEF呈負相關(guān)（P＜0.05）；miR-150與hs-CRP、左心房內(nèi)徑、MMP-9呈負相關(guān)（P＜0.05），與LVEF呈正相關(guān)（P＜0.05）（表5）。

2.5 miR-133a和miR-150診斷價值miR-133a、miR-150單獨診斷以及二者聯(lián)合診斷靈敏度分別為78.1%、83.6%、90.4%，特異度分別為68.0%、68.0%、84.0%、，ROC曲線下面積（AUC）分別為0.693、0.705、0.812。與miR-133a、miR-150單獨診斷相比，二者聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度以及AUC均顯著提高（P＜0.05），結(jié)果如圖1所示。

表3 對照組和房顫患者血清miR-133a和miR-150表達水平比較

表4 不同類型房顫患者血清miR-133a和miR-150比較

表5 房顫患者血清miR-133a和miR-150與各檢測指標(biāo)相關(guān)性

圖1 miR-133a、miR-150以及二者聯(lián)合診斷的ROC曲線

2.6 logistic回歸分析Logistic回歸分析結(jié)果顯示，與hs-CRP、左心房內(nèi)徑、LVEF和MMP-9類似，miR-133a和miR-150也是影響房顫的因素（P＜0.05），結(jié)果如表6所示。

表6 logistic回歸分析

3 討論

房顫是一種多因素誘導(dǎo)、多機制參與的心律失常。隨著人口老齡化加劇，房顫的發(fā)病率不斷增加，80歲以上人群患病率超過8%[7]。房顫患者存在心力衰竭、腦卒中等嚴(yán)重的心血管疾病并發(fā)癥，一直以來都是研究的重點。目前，在心律失常尤其是房顫的診斷方面，缺少有效的診斷指標(biāo)來預(yù)測或診斷其發(fā)生情況。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測房顫患者血清miR-133a和miR-150表達水平并分析其臨床意義，以期為房顫的臨床診斷探尋新的方法或分子標(biāo)記物。

隨著對miRNAs研究的的深入，發(fā)現(xiàn)miRNAs參與心力衰竭、心律失常、冠心病等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，可通過調(diào)控不同靶基因在房顫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。miR-133a是肌肉特異性miRNA，在心肌中特異性表達，參與調(diào)節(jié)心肌細胞增殖和分化，可以通過抑制心肌縫隙連接蛋白和離子通道蛋白的表達參與心律失常的發(fā)生。徐振宇等[9]研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭（CHF）患者血清miR-133a表達水平顯著升高，其表達水平與LVEF呈負相關(guān)，與左心房內(nèi)徑呈正相關(guān)，檢測CHF患者血清miR-133a變化有助于判斷患者心室重構(gòu)情況。miR-150定位于人19號染色體，主要表達于心肌組織、淋巴結(jié)和脾臟等組織或器官。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150參與組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展。心肌纖維化能夠造成心機結(jié)構(gòu)重構(gòu)，進而導(dǎo)致房顫的發(fā)生。周小翠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死邊緣區(qū)miR-150表達水平顯著下降，上調(diào)其表達可通過作用靶基因c-Myb改善心肌纖維化。李冰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者射頻消融術(shù)前血漿miR-150水平較健康體檢者顯著降低，術(shù)后miR-150水平較術(shù)前顯著升高，miR-150可能與房顫的發(fā)病機制相關(guān)，并能調(diào)控疾病的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與對照組比，房顫患者血清miR-133a水平顯著升高，miR-150水平顯著降低。除此之外，不同類型的房顫患者血清miR-133a和miR-150比較差異也顯著，提示miR-133a和miR-150均參與房顫的發(fā)生、發(fā)展過程，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。 血清作為生物檢測的樣本，具有取材方便、無創(chuàng)傷等優(yōu)點，因此，血清miRNA可作為診斷房顫或其他疾病發(fā)生的生物標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示，miR-133a、miR-150單獨診斷房顫發(fā)生具有一定的靈敏度和特異度，二者聯(lián)合診斷時靈敏度和特異度顯著提高，AUC增加，提示miR-133a和miR-150聯(lián)合檢測對于房顫的診斷具有較大的參考價值。

心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫發(fā)生和維持過程中起重要作用。心房間質(zhì)纖維化會導(dǎo)致心肌壁變薄、心房擴張、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)等[12]。房顫患者心房明顯纖維化，且隨著纖維化程度越嚴(yán)重，房顫發(fā)生的可能性也越大。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9參與心肌纖維化，影響心肌結(jié)構(gòu)重置[13]。本研究結(jié)果顯示，房顫患者MMP-9水平較對照組顯著升高，且不同類型房顫患者MMP-9水平比較差異顯著，與相關(guān)研究報道一致[13,14]。房顫患者血清miR-133a與MMP-9呈正相關(guān)，miR-133a過表達可能通過抑制胰島素1號生長因子介導(dǎo)MMP-9表達上調(diào)，參與房顫患者心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和膠原代謝。超敏C-反應(yīng)蛋白（hsCRP）與心血管疾病關(guān)系密切，hsCRP在房顫炎性標(biāo)志物的臨床應(yīng)用中最為廣泛。李硯杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者hsCRP較對照組顯著增加，且陣發(fā)性、持續(xù)性、永久性房顫患者之間比較差異顯著，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，房顫患者血清miR-133a與hs-CRP呈正相關(guān)，miR-150與hs-CRP呈負相關(guān)，提示miR-133a和miR-150也可作為血清標(biāo)志物用于判斷房顫患者嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。房顫過程與心房結(jié)構(gòu)改變相關(guān)，研究證實，房顫患者心房直徑增加。本研究結(jié)果顯示，房顫患者左心房內(nèi)徑較對照組增加，且不同類型患者之間比較差異顯著，與報道結(jié)果一致[16]。房顫患者血清miR-133a與左心房內(nèi)徑呈正相關(guān)，miR-150與左心房內(nèi)徑呈負相關(guān)，提示miR-133a和miR-150可能通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶活性、間質(zhì)纖維化等進而增加心房直徑。

綜上所述，房顫患者血清miR-133a和miR-150均表達異常，參與房顫發(fā)生、發(fā)展。聯(lián)合檢測血清miR-133a和miR-150有望作為房顫患者發(fā)生風(fēng)險的生物學(xué)標(biāo)志物，通過深入研究miR-133a和miR-150在該疾病中的作用機制，可為房顫治療提供新的藥物作用靶點。