細胞實驗系統(tǒng)評價制作流程的構建

趙霏，趙晉，郭忠，宋雷，張婷，姜彥彪，鄺心穎，馬彬

細胞實驗也稱為體外實驗（in vitro studies/experiments），是指實驗對象為各種動物或植物細胞、微生物、細胞器、編碼基因、表達蛋白或細胞功能的研究，是基礎研究領域中不可或缺的一類實驗，其結果對下一步動物實驗和臨床試驗的設計與實施均具有重要的指導意義[1]。

相較于臨床試驗，細胞實驗具有操作技術及方法多樣性、同一實驗多次實施后結果不一致、細胞來源及種屬對實驗結果影響大等特點，因此會出現(xiàn)實驗方法難以選擇、實驗可重復性差、實驗結果難以整合解釋等諸多問題[2]。故有必要開展細胞實驗系統(tǒng)評價/Meta-分析（SRs/MAs），以降低將細胞實驗所獲結果引入動物實驗和臨床研究的風險，最終提高其結果對后續(xù)動物實驗和臨床研究的指導價值。但相較于系統(tǒng)評價在臨床領域中的廣泛采納和應用，其在細胞實驗中的應用還很少[3]。此外，由于缺乏細胞實驗系統(tǒng)評價檢索策略和納入研究質量評價方法的標準，大部分已經發(fā)表的細胞實驗SR均存在如檢索不完全或無標準的工具進行質量評價等問題[4]。

因此，本文將在循證方法學的基礎上介紹細胞實驗系統(tǒng)評價的制作流程和步驟，為細胞實驗系統(tǒng)評價的開展和實施提供相關參考，以期提高細胞實驗系統(tǒng)評價的質量。

1 資料與方法

1.1 納入/排除標準納入與細胞實驗SRs/MAs的制作流程/方法/步驟、偏倚風險評估工具、檢索策略制定方法和報告規(guī)范等相關的中英文文獻。對納入研究偏倚風險的準確評估和檢索策略的規(guī)范制定與報告是影響系統(tǒng)評價結果真實性和科學性的重要影響因素，因而對于某一具體問題的細胞實驗SRs/MAs，僅納入對其納入研究的偏倚風險進行了評估，和/或提供至少一個數(shù)據(jù)庫檢索策略的SRs/MAs研究。排除重復發(fā)表文獻、會議摘要和綜述等。此外，本研究中定義的“細胞實驗”是指從始至終在體外或細胞上進行的研究，不應包括前期開展臨床干預治療，隨后將臨床樣本（如血液和腦脊液等）進行后續(xù)實驗的研究。

1.2 文獻檢索策略計算機檢索PubMed、CNKI和萬方數(shù)據(jù)庫，檢索時間從建庫截至2017年10月。中文檢索詞包括細胞實驗、體外實驗、體外研究、臨床前實驗、原始實驗、系統(tǒng)評價、薈萃分析、元分析、Meta分析、報告規(guī)范、報告指南、檢索策略、方法學等；英文檢索詞包括preclinical study、cell experiment、cell test、in vitro experiment、in-vitro study、systematic review、Meta-analysis、methodology、protocol、guidance、guideline、reporting guideline、search guide、search strategy、search filter等。其中PubMed的檢索策略參見框1。

框1 PubMed數(shù)據(jù)庫的檢索策略

1.3 文獻篩選由2名評價員（趙霏、張婷）分別篩選文獻，意見不統(tǒng)一時通過討論或由第三名研究人員（馬彬）協(xié)助解決。

1.4 研究方法對納入研究進行描述性分析。

2 結果

2.1 文獻篩選流程及結果初檢共獲得相關文獻985篇（中文622篇，英文363篇），經逐層篩選，最終納入16篇研究[5-20]，包括中文1篇，英文15篇。文獻篩選流程及結果見圖1。

2.2 細胞實驗系統(tǒng)評價與臨床試驗系統(tǒng)評價的區(qū)別細胞實驗滲透于醫(yī)學研究領域各個方面，其目的在于探討某一課題或假說的真實性，從而揭示疾病的發(fā)生發(fā)展及治療等內在機制，從而為進一步的動物實驗和臨床試驗提供理論基礎，同時對動物實驗和臨床試驗的研究設計與具體實施方法提出合理的指導意見。

圖1 文獻篩選流程及結果

與傳統(tǒng)干預性臨床試驗系統(tǒng)評價一樣，細胞實驗系統(tǒng)評價本質上仍屬于干預性系統(tǒng)評價。但由于原始細胞實驗的特殊性，如：①即使不同的研究團隊選用同一種細胞株進行實驗，但由于細胞來源、培養(yǎng)條件和實驗操作技術差異等原因，也較難得出完全一致的實驗結果。因此，不同細胞實驗間的異質性來源和程度均更加復雜；②細胞實驗的結局指標多是采用如PCR、WB實驗的手段對結果進行定性描述；③對于細胞實驗的質量評價，有些動物實驗或臨床研究的偏倚風險評估工具并不適用。本研究團隊依據(jù)目前已發(fā)表的細胞實驗SR和臨床試驗SR，總結出二者之間的區(qū)別（見表1），供研究者參考。因而，細胞實驗SR的制作不可完全仿照臨床/動物實驗SR的制作流程，應具有其自身特點。

2.3 細胞實驗系統(tǒng)評價的制作流程同臨床試驗/動物實驗系統(tǒng)評價類似，細胞實驗系統(tǒng)評價的開展和實施也包括8個步驟[21,22]: ①提出并明確研究問題；②制定納入/排除標準；③證據(jù)來源與檢索；④文獻篩選；⑤納入研究偏倚風險評估；⑥資料提??；⑦合并單項研究結果，并在可能的情況下進行Meta分析；⑧數(shù)據(jù)結果呈現(xiàn)及異質性分析。

2.3.1 提出并明確研究問題借鑒臨床試驗系統(tǒng)評價結構化研究問題的原則[2]，一個目的明確的細胞實驗系統(tǒng)評價的研究問題同樣需要包含以下5個方面的核心要素：①細胞實驗的研究對象（participants，P）；②具體的干預措施或暴露因素（intervention/exposure，I/E）；③進行的對照處理措施（comparisons，C）；④結局測量指標（outcomes，O）；⑤實驗設計類型（studydesign，S）。

表1 細胞實驗SR和臨床試驗SR的區(qū)別

例如，預探討“灰樹花多糖誘導腫瘤細胞凋亡的作用”。針對這一選題，按以上原則，對研究問題進行結構化處理：①“P”為腫瘤細胞；②“I”為灰樹花多糖處理；③“C”可為灰樹花多糖以外的處理方法，包括生理鹽水/PBS處理或不處理等，不進行嚴格限定；④“O”為檢測細胞凋亡的結果指標，如TUNEL染色法、流式細胞術檢測凋亡率、凋亡相關蛋白表達等凡是能檢測細胞凋亡的方法；⑤“S”為細胞實驗。

2.3.2 制定納入/排除標準同動物實驗SRs/MAs一樣，細胞實驗SRs/MAs的納入和排除標準的制定也應體現(xiàn)結構化問題中所涉及的核心要素[22]。本文以Golbach LA等的研究[12]（該研究探討體外實驗中低頻輻射（LF MF）暴露對細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的影響，后文中用GLA代指該研究）為例，具體說明如何制定細胞實驗系統(tǒng)評價的納入/排除標準。

（1）研究對象：為體外培養(yǎng)的細胞或細胞內容物，如正常人體細胞或腫瘤細胞、動物細胞、細胞內某段功能基因或蛋白等，也可以是細胞的某一功能，如分泌、遷移、蛋白表達等。如在GLA的研究中，研究對象為動物或人體細胞，排除原核生物、藻類或真菌細胞。

（2）干預措施/暴露因素：即對細胞進行的各種處理，可為藥物、X線照射、特殊染色等，以及具體干預方案。如在GLA的研究中，干預措施為頻率為1～300 Hz之間的LF MF暴露，排除靜態(tài)磁場暴露。同時需要報告暴露的細節(jié)，以便可以合理量化曝光參數(shù)的不確定性，從而可重復暴露條件。

（3）對照措施：可為空白對照，或陰性對照如生理鹽水、PBS等；也可為另一種不同的干預措施。同樣，需要闡述其具體干預方案。此外，若為多種干預方案比較，應對實驗組和對照組細胞的干預措施均進行詳細的規(guī)定及描述。如在GLA的研究中，對照措施并未限定，可為空白對照、或其他相關暴露條件。

（4）結局測量指標：需檢測的實驗結果指標，取決于實驗研究的目的，多為某一細胞的特定功能，如細胞因子的分泌水平，凋亡水平或自噬活性等，也可為某一分子的基因或蛋白表達水平。實驗結果可為定性指標（如Western blot等指標）或定量指標（如細胞抑制率、凋亡率等指標）。如在GLA的研究中，結局指標為細胞內實際測量到的鈣離子濃度，排除應用抑制劑或路徑鉗夾實驗后的鈣離子濃度。

（5）實驗設計類型：細胞/體外實驗，即從始至終在體外或細胞上進行的研究。如在GLA的研究中，納入體外實驗或細胞實驗。

2.3.3 證據(jù)來源與檢索目前，對細胞實驗系統(tǒng)評價檢索數(shù)據(jù)庫的選擇、檢索策略的制定和報告、“體外實驗”檢索過濾器等方面，并無相關的方法研究，也未形成統(tǒng)一規(guī)范或共識。已發(fā)表的細胞實驗系統(tǒng)評價中，在這些方面均有差異[8,12-19]。因此參考動物實驗系統(tǒng)評價檢索策略制定規(guī)范[23]，以及目前報告了詳細檢索策略及來源的細胞實驗系統(tǒng)評價[14,16,18,19]，同時考慮細胞實驗特性，對細胞實驗系統(tǒng)評價檢索數(shù)據(jù)庫的選擇和檢索策略的制定等建議如下：

2.3.3.1 數(shù)據(jù)庫選擇檢索數(shù)據(jù)庫除PubMed/MEDLINE、EMbase和Web of Science外，還需要檢索系統(tǒng)評價研究者所在國家和地區(qū)的專業(yè)數(shù)據(jù)庫。例如對中國的研究者而言，至少需要加入CBM、WanFang Data、CNKI 等中文數(shù)據(jù)庫。此外，根據(jù)系統(tǒng)評價課題的具體要求，可選取相關專業(yè)數(shù)據(jù)庫如Scopus、Science Direct、CINAHL、LILACS、中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫等。

2.3.3.2 補充檢索雖然早在2005年就開始認同并設立臨床試驗全球注冊制度[24]，而且已有專門的組織（EQUATOR Network）[25]開展并建立了一系列臨床試驗和動物實驗的報告規(guī)范。但目前，對細胞實驗而言，尚無相關的實驗注冊機制和要求，亦未研發(fā)和建立其規(guī)范的報告標準，細胞實驗中陰性結果的報告比臨床試驗更難估計。因此，重視對未發(fā)表研究、陰性結果研究等灰色文獻的收集和獲取是降低細胞實驗系統(tǒng)評價研究發(fā)表偏倚的重要手段之一。因此，建議可通過Google或百度檢索、Open Grey檢索、OpenSIGLE檢索，查詢會議論文集等多種途徑，盡可能獲取細胞實驗相關會議摘要、實驗室數(shù)據(jù)等灰色文獻[23]。

2.3.3.2 檢索策略的制定和報告首先，確定檢索詞的來源和范圍。細胞實驗系統(tǒng)評價檢索詞的來源和選擇應該僅僅圍繞所提出問題包含的核心要素（如上例所示5方面核心要素），其中“P”（細胞或細胞功能）、“I”（干預措施）和“O”（結局指標）相關的檢索詞為必須檢索的檢索詞。其中對于“O”（結局指標）而言，由于在確定細胞實驗系統(tǒng)評價選題時，對結局指標已經明確，如對細胞某項功能改變的影響。因此，“O”相關的檢索詞也必須進行檢索。對于“C”（對照組處理方法）和“S”（體外實驗）相關檢索詞而言，根據(jù)該系統(tǒng)評價的范圍和要求進一步確定是否需要檢索，例如已明確或限定“C”的范圍，則其相關檢索詞也需要檢索；反之，不需要。而對于“S”（體外實驗），若“P”已明確為某種細胞，如A549肺癌細胞，則不需要檢索“S”；若“P”僅限定為某一種疾病，則需要同時檢索“S”。

其次，確定檢索式，也就是檢索詞之間的邏輯組配關系（ANDOR NOT）。其基本原理是，同一概念下的檢索詞之間用OR連接，不同概念下的檢索詞之間用AND連接。因此，細胞實驗系統(tǒng)評價中，檢索式應該為“P”AND “C”（根據(jù)具體情況選擇是否需要）AND “O”（結局指標）AND “S”（根據(jù)具體情況選擇是否需要）。

對于細胞實驗系統(tǒng)評價檢索策略的報告而言，目前并無共識，亦無相關方法研究探討。我們借鑒臨床試驗系統(tǒng)評價檢索策略的報告認為，細胞實驗系統(tǒng)評價檢索策略報告應包括檢索數(shù)據(jù)庫來源、檢索時間范圍、語種限制、檢索詞及完整的檢索策略等信息。

2.3.3.3 “體外實驗”檢索過濾器由于目前尚無針對“細胞/體外實驗”的檢索過濾器。筆者參考國內外文獻中對“體外實驗”概念及已發(fā)表的細胞實驗SRs/MAs，制定了如框2所示的“體外實驗”的檢索過濾器，供今后細胞實驗系統(tǒng)評價/Meta分析制作者參考。

2.3.4 文獻篩選和資料提取

2.3.4.1 方法細胞實驗系統(tǒng)評價文獻篩選和資料提取方法與臨床試驗系統(tǒng)評價并無差異。首先，確定文獻篩選和資料提取流程，排除的標準，提取注意事項等。然后，確定篩選和提取的具體方法、篩選和提取人員的準入標準等，以保證篩選和資料提取過程的科學性和標準化。推薦，需要至少兩名評價員獨立完成并進行交叉核對，其具體方法原則可參見《系統(tǒng)評價指導手冊》[21]。

框2 “細胞/體外實驗”的檢索濾器

2.3.4.2 內容細胞實驗系統(tǒng)評價資料提取內容，除一些基本特征外，特別需要注意對細胞實驗重要特點方面資料的提取，如研究對象（包括細胞的來源、類型、種屬、培育條件等）、干預措施（包括對照設置、細胞處理方式等）和結局指標（檢測技術如流式細胞術或ELISA等、測量結果）等方面相關數(shù)據(jù)的提取。

2.3.5 納入研究的偏倚風險評估目前，并無針對細胞實驗內在偏倚風險評估工具的方法學研究，已發(fā)表的細胞實驗系統(tǒng)評價中所采用的標準和工具均不同，有些直接將臨床試驗[5,6,9,20]、或動物實驗偏倚風險評估的工具[10,15,18]直接移植過來使用，尚無公認的標準和工具。因此，我們借鑒Cochrane Handbook推薦的隨機對照試驗偏倚風險工具（Cochrane Risk of Bias，ROB）[26]和SYRCLE動物實驗風險評估工具[27]，參考已發(fā)表細胞實驗系統(tǒng)評價采用的偏倚風險評估條目，結合細胞實驗的特性，提出了如表2所示的細胞實驗偏倚風險評估條目，包含6類偏倚類型共21個條目。其中，偏倚類型與Cochrane ROB一致，每個條目的評估結果最終以“是”（納入研究中明確報告判斷的相關內容）、“否”（未報告與相關判斷內容）、“不確定”（信息提供不充分，無法判斷）表示，其中“是”代表低風險偏倚，“否”代表高風險偏倚，“不確定”代表不確定風險偏倚。

2.3.6 合并單項研究結果，根據(jù)情況進行Meta分析及異質性分析

2.3.6.1 結局指標的轉化處理由于細胞實驗結果展示的多樣性，提取的結局指標如何轉化是細胞實驗SR的難點之一。例如，對于檢測陽性細胞率的實驗，如MTT、ELISA、細胞凋亡率等實驗結果，可將每一個細胞視為個體，根據(jù)實驗前細胞數(shù)量和陽性細胞數(shù)目把實驗結果轉化成二分類變

量數(shù)據(jù)；對于某一細胞因子的分泌量等指標，可視其為連續(xù)型變量，采用均數(shù)±標準差的形式合并數(shù)據(jù)；對于如WB、PCR等趨勢性實驗結果，可用Image J等軟件將結果提取出數(shù)據(jù)，進而轉換成連續(xù)型變量進行合并[12,28]。

表2 細胞實驗內在偏倚風險評估工具

2.3.6.2 異質性分析Meta分析的優(yōu)勢在于可增加檢驗效能、提高結論準確性、解決不同研究間相互矛盾的結論所引發(fā)的爭論等[25]。該統(tǒng)計方法同樣適用于細胞實驗系統(tǒng)評價，但與臨床試驗系統(tǒng)評價存在一定的差異，如臨床試驗的研究對象為人群，個體間差異很小，而細胞實驗的研究對象為各種各樣的細胞，不同來源和種屬的細胞在對藥物的敏感性以及細胞代謝過程等方面的差異很大。此外，細胞實驗在實施中由于技術手法、生長環(huán)境不同等造成的細胞生長狀態(tài)間的差異也不可忽視。納入研究間異質性是細胞實驗系統(tǒng)評價制作中的很大挑戰(zhàn)。

細胞實驗系統(tǒng)評價中，納入研究的異質性同樣包括研究內和研究間兩方面，前者指樣本內各觀察單位之間可能存在的差異。在細胞實驗中為單個細胞，由于生長狀態(tài)不同可能會有些許差異，但是實驗所采用的同批同種細胞間差異十分小，可以忽略不計；后者指由于研究對象來自于不同的總體以及偏倚的控制等諸多方面的差異。由于細胞實驗的特殊性，此方面的異質性更明顯。如某一中藥的抗腫瘤作用，可以在肝癌、胃癌或者乳腺癌細胞上都能觀察到，在合并效應量時如果不考慮腫瘤細胞種屬的來源問題，直接對多種細胞的抑制作用進行合并，則不可避免會產生異質性。此時，為避免產生異質性，可采用亞組分析的方法，即將同一種屬來源細胞株的結局指標進行合并。

此外，細胞實驗中干預措施具體實施方法間的差異也可造成某些偏倚的產生，由此而產生的異質性也不可避免。理想的狀態(tài)是實驗中的干預措施應建立在對所有研究對象均無偏倚風險的基礎上，包括在干預時間、頻率、劑量、實驗操作及最短時間控制等方面均一致。但在實驗實施過程中，完全消除這方面的差異較難實現(xiàn)，因而可采用亞組分析、Meta回歸、敏感性分析等多種方式探討異質性來源，并在一定程度上降低亞組間異質性。細胞實驗系統(tǒng)評價/Meta分析中對于異質性檢驗的方法與臨床研究的系統(tǒng)評價/Meta分析一致。當定量Meta分析不適合時亦可采用其他合成研究的方法，如描述性系統(tǒng)評價的方法。

3 結論

一個經過嚴謹設計、規(guī)范實施步驟的細胞實驗系統(tǒng)評價，一方面可避免出現(xiàn)方法學上的缺陷，最小化系統(tǒng)評價研究中的偏倚，有利于證據(jù)使用者對其結果的客觀評估。另一方面可促進研究人員對相關課題的動物實驗和/或臨床試驗的設計進行更廣泛的思考，避免實驗設計的缺陷及不必要的實驗實施中的浪費。本研究目的在于為構建出細胞實驗系統(tǒng)評價規(guī)范的流程提供參考。同樣的，高質量的細胞實驗系統(tǒng)評價的開展與推進，需要不同專業(yè)領域中的研究者們未來更多、更深入的研究。