螺內(nèi)酯對代謝綜合征大鼠心肌重構(gòu)的干預(yù)作用＊

張小云，張旭升，黃戰(zhàn)軍，樊小容，譚小青，蔡博治

代謝綜合征（metablicsyndrome，MS）包括糖耐量減低、中心性肥胖、脂代謝紊亂、高尿酸血癥、高血壓及心腦血管疾病。大量研究證實(shí)，MS可引起血管內(nèi)皮功能障礙、動(dòng)脈粥樣硬化及心肌纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展，最終導(dǎo)致心血管重構(gòu)［1，2］。MS 誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)過程非常復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)其與高血脂、胰島素抵抗及高血壓等相關(guān)，分子機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、血管活性肽及脂肪細(xì)胞因子等作用相關(guān)。而醛固酮［2］（ALD）是體內(nèi)具有促體內(nèi)多種器官組織纖維化的活性因子，尤其與心血管重構(gòu)的關(guān)系密切，主要與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合發(fā)揮各種生物學(xué)效應(yīng)，但是否參與MS誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)目前尚不清楚。為此，該研究通過建立MS模型鼠誘導(dǎo)心肌重構(gòu)，并觀察該過程中ALD及其受體的表達(dá)和變化；采用醛固酮受體阻滯劑螺內(nèi)酯干預(yù)，觀察其對心肌重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、儀器及動(dòng)物雄性SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。高果糖飼料購自北京華阜康生物科技有限公司；醛固酮放射免疫試劑盒購自北京華英生物研究所；鹽皮質(zhì)激素受體一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其余為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。血糖試紙及快速血糖儀購自美國雅培；鼠尾動(dòng)脈無創(chuàng)測壓儀由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；Beckman Coulter AU5800由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2 MS動(dòng)物模型制備取雄性SD大鼠8只作為正常對照組，普通飼料喂養(yǎng)；取雄性SD大鼠16只作為MS組，用高果糖飼料喂養(yǎng)10周，檢測尾動(dòng)脈壓、血糖和血脂水平，以確定MS模型建立成功。將造模成功的MS大鼠隨機(jī)分成MS組（8只）和MS+螺內(nèi)酯組（8只），均繼續(xù)高果糖喂養(yǎng)，MS+螺內(nèi)酯組每天予螺內(nèi)酯40 mg/kg·d灌胃1次。4周后稱重，3%水合氯醛麻醉，從心臟取血，將部分血液置入含有EDTA的試管中，4℃離心分離血漿，-80℃冰箱保存。迅速分離出心肌標(biāo)本，切取部分心肌組織，用冰生理鹽水洗凈殘余血液，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋用于染色，其余錫紙包裹，-80℃冰箱保存。

1.3 血壓、血糖和三酰甘油的測定采用鼠尾動(dòng)脈測壓儀測量血壓；禁食8 h后尾動(dòng)脈取血，快速血糖儀檢測血糖，并迅速用離心機(jī)分離出血清，使用Beckman Coulter AU5800生化儀檢測血清三酰甘油水平。

1.4 心肌組織膠原Masson染色取大鼠心肌組織，用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，制作4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化、脫水，進(jìn)行Masson染色。在光鏡下觀察、照相，進(jìn)行圖像學(xué)分析。

1.5 血漿和心肌ALD含量的測定將血漿和心肌組織標(biāo)本用干冰保存，送北京華英生物研究所，采用放射免疫法測定血漿和心肌組織中ALD含量，具體步驟按試劑盒說明書操作。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測心肌組織鹽皮質(zhì)激素受體的表達(dá)取心肌組織制備組織切片，石蠟包塊，制作4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟入水，抗原修復(fù)，封閉非特異性抗原，滴加鹽皮質(zhì)激素受體一抗過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graph pad prism4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MS模型特征使用高果糖飼料喂養(yǎng)大鼠10周后，其平均動(dòng)脈壓、血糖、三酰甘油水平明顯高于正常對照組，提示建模成功，見表1。

表1 兩組間平均動(dòng)脈壓、血糖、血脂比較（±s）

表1 兩組間平均動(dòng)脈壓、血糖、血脂比較（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01。

三酰甘油（mmol/L）正常對照組 8 102.65±7.25 0.85±0.55 2.22±0.55 MS 組 16 128.85±6.85＊ 2.68±0.61＊ 6.78±0.67＊組別 n 平均動(dòng)脈壓（mmHg）血糖（mmol/L）

2.2 大鼠心肌組織Masson染色采用Masson染色觀察大鼠心肌組織，與正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)MS大鼠心肌組織有明顯膠原沉積，心肌細(xì)胞排列紊亂。用螺內(nèi)酯干預(yù)后，心肌膠原沉積有所改善。見圖1。

圖1見封三。

2.3 大鼠血漿和心肌組織ALD含量的變化MS組心肌組織ALD表達(dá)明顯增加，采用螺內(nèi)酯干預(yù)后，ALD表達(dá)明顯下調(diào)；3組血漿醛固酮水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 血漿和心肌組織醛固酮含量比較（±s）

表2 血漿和心肌組織醛固酮含量比較（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與 MS 組比較，#P＜0.01。

組別 n 心肌組織ALD（ng/g蛋白）血漿ALD（ng/L）正常對照組 8 8.25±1.55 86.45±5.55 MS 組 8 27.65±3.55＊ 91.47±5.85 MS+螺內(nèi)酯組 8 18.55±6.23＊# 90.55±5.25

2.4 大鼠心肌組織鹽皮質(zhì)受體表達(dá)的變化與正常組相比，MS組心肌組織鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)明顯上調(diào)，用螺內(nèi)酯干預(yù)后，心肌組織鹽皮質(zhì)激素受體表達(dá)有所下調(diào)。見圖2。

圖2見封三。

3 討論

MS與許多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是目前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)MS大鼠模型可出現(xiàn)心肌重構(gòu)，表現(xiàn)在心肌細(xì)胞排列紊亂，膠原蛋白沉積明顯。其分子機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)、部分血管活性肽如尾加壓素Ⅱ及脂肪細(xì)胞因子作用等相關(guān)［2-4］。因此，探索參與MS心肌重構(gòu)的因子，對于揭示心肌重構(gòu)機(jī)制并為其防治提供新的臨床策略具有重要意義。

ALD是腎素-血管腎張素-醛固酮系統(tǒng)（RASS）的終末激素，也是體內(nèi)重要的鹽皮質(zhì)類固醇激素，ALD主要通過經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶途徑和心血管等組織自分泌/旁分泌的方式產(chǎn)生。其中心血管組織的ALD合成不受血漿ALD水平的影響，可以單獨(dú)作用于血管壁、心肌組織，可引起局部組織炎癥反應(yīng)、纖維化、膠原蛋白及鈣鹽的沉積等，因此ALD 在心血管重塑過程中起著重要的作用［2，5-7］。 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用高果糖飼料喂養(yǎng)大鼠后，其血壓、血糖及三酰甘油明顯高于正常對照組，成功建立MS大鼠動(dòng)物模型。采用Masson染色，觀察到心肌組織全程均有膠原蛋白明顯沉積，心肌細(xì)胞排列紊亂，提示心肌重構(gòu)。與此同時(shí)，心肌組織ALD含量與其相應(yīng)受體表達(dá)明顯增加，誘導(dǎo)局部組織炎癥反應(yīng)、膠原沉積等生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)一步加重心肌重構(gòu)的進(jìn)展。因此，采用ALD特異受體拮抗劑螺內(nèi)酯干預(yù)，可逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)這一病理過程。而三組大鼠血漿ALD水平無明顯差異，這提示醛固酮/鹽皮質(zhì)激素受體系統(tǒng)可能參與了MS大鼠心肌重構(gòu)的過程，并且是通過自分泌/旁分泌的方式起作用的。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALD能通過氧化應(yīng)激等機(jī)制，誘導(dǎo)心血管組織周圍炎癥反應(yīng)，如細(xì)胞黏附分子-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子α等炎癥因子的表達(dá)增加，導(dǎo)致血管、心肌局部組織纖維化的發(fā)生發(fā)展，而選擇性ALD受體拮抗劑能降低炎癥因子的表達(dá)，延緩心肌和血管的損傷。外源性醛固酮還可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原蛋白合成［6，7］，而細(xì)胞增殖和細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白的沉積是心血管纖維化過程中重要的病理?xiàng)l件。所以，ALD與心血管重構(gòu)事件的發(fā)生密切相關(guān)，該課題組亦在動(dòng)物血管鈣化模型中證實(shí)ALD可促進(jìn)大鼠血管鈣化及纖維化的進(jìn)程［8，9］，涉及的分子機(jī)制與炎癥反應(yīng)等相關(guān)。綜上所述，在病理狀態(tài)下，局部組織ALD水平表達(dá)增加（旁分泌、自分泌的方式），通過結(jié)合鹽皮質(zhì)激素受體，激活相關(guān)分子途徑如誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等作用，通過Rho激酶等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［10，11］，刺激心肌細(xì)胞增殖、膠原沉積等，促進(jìn)心肌重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。

ALD曾被認(rèn)為主要起調(diào)節(jié)體內(nèi)鈉鉀離子平衡的作用，隨著研究不斷深入，它不僅是體內(nèi)重要的促纖維化物質(zhì)，還是重要的促炎癥因子。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MS大鼠心肌重構(gòu)，心肌組織醛固酮/鹽皮質(zhì)激素受體的表達(dá)明顯增加，提示醛固酮/鹽皮質(zhì)激素受體系統(tǒng)參與了心肌重構(gòu)的過程，用螺內(nèi)酯干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)該過程，為心肌重構(gòu)的機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，并為防治提供新的臨床思路，其內(nèi)在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。