循環(huán)腫瘤DNA研究進展及其臨床應(yīng)用現(xiàn)狀＊

高明正，張 瑾，潘 云，李 艷

循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）可以利用患者的血液及其他體液（如尿液、唾液等）檢測癌癥的成分及來源。循環(huán)腫瘤DNA作為液態(tài)活檢（liquid biopsy）中的一部分，能夠?qū)崟r反映腫瘤狀態(tài)，通過對其檢測可以快速實現(xiàn)疾病分子的鑒定，有利于疾病的早期診斷、準(zhǔn)確預(yù)后、疾病監(jiān)測及個體化治療。隨著科技及醫(yī)療的不斷進步，腫瘤分子研究的不斷深入，ctDNA與腫瘤相關(guān)的研究不斷被報道，下面就對ctDNA進行詳細(xì)介紹。

1 ctDNA的生物學(xué)特征

ctDNA，指外周血液循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤基因組的游離DNA，這些游離的片段反映了腫瘤的信息［1］循環(huán)游離 DNA（circulating free DNA，cfDNA）即非細(xì)胞結(jié)合的DNA，存在于血清或血漿細(xì)胞外的DNA，是無創(chuàng)唐氏篩查的基礎(chǔ)。1948年mandel等［2］首次描述了人血液中循環(huán)游離DNA。隨后Leon等［3］于1977年發(fā)現(xiàn)cfDNA的濃度在癌癥患者中明顯高于非癌癥患者，開辟了后續(xù)一系列的研究。ctDNA來源于腫瘤的壞死、腫瘤凋亡、腫瘤細(xì)胞直接分泌以及外泌體的釋放［4-7］。 cfDNA 含量及完整性［8-10］ctDNA 突變頻率［11-13］、微衛(wèi)星雜合性［14］以及甲基化頻率［15-17］這些都可以進行研究。cfDNA片段大小不一，主要受到提取方法、腫瘤釋放方式的影響，測序發(fā)現(xiàn)cfDNA的大小主要集中在180 bp左右，長度為包裹在核小體蛋白復(fù)合物上DNA的長度［18-19］。且對于非突變的cfDNA來說，長度要長于ctDNA［20］。ctDNA的含量通常占總循環(huán)游離DNA的0.01%［21，22］這對臨床檢測來說是一種挑戰(zhàn)。cfDNA的半衰期較短，數(shù)min到2.5 h不等，可以實時監(jiān)測體內(nèi)ctDNA的變化［23-25］。

2 ctDNA檢測的相關(guān)技術(shù)

ctDNA帶有與原發(fā)腫瘤相關(guān)的遺傳信息，在研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展、個體化醫(yī)療具有重大意義。半衰期比較短，能夠精確評估數(shù)小時的腫瘤變化，比影像學(xué)或蛋白標(biāo)記早數(shù)周甚至數(shù)月發(fā)現(xiàn)腫瘤的改變；較高的特異性，避免了假陽性的結(jié)果；代表腫瘤負(fù)荷，能評估腫瘤的動態(tài)；濃度水平隨著疾病進展而增加，也會因為藥物治療或者手術(shù)而降低，可以檢測腫瘤對于治療的反應(yīng)、評估患者治愈情況及殘留病灶情況，從而防止疾病的復(fù)發(fā)；臨床通過對腫瘤相關(guān)分子的檢測揭示腫瘤發(fā)生的機制，從而對作用靶點“對癥下藥”，精準(zhǔn)治療到每例患者與精準(zhǔn)醫(yī)療的主題相契合。雖然技術(shù)應(yīng)用場景廣闊、優(yōu)勢明顯、市場潛力巨大，但是在實際的臨床應(yīng)用和推廣方面還面臨著一系列的挑戰(zhàn)，比如數(shù)量少、需要擴增、檢測方法靈敏性較低，如何進行高效的捕獲與檢測成為重要環(huán)節(jié)。隨著科技的發(fā)展、醫(yī)療水平的提高，相對應(yīng)地更特異性與靈敏性的捕獲檢測技術(shù)被開發(fā)出來。

檢測ctDNA的技術(shù)主要有：Sanger法、實時熒光定量 PCR（real-time PCR，RT-PCR）、二代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）、突變擴增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）、質(zhì)譜法 （mass spectrometry，MS）、數(shù)字 PCR（digital PCR，dPCR）： 包括 BEAMing和微滴式數(shù)字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）。 標(biāo)記擴增深度測序（TAM-Seq）、 癌癥個體化深度測序 （CAPP-Seq）等（表1）。利用這些技術(shù)對ctDNA進行檢測，及時了解患者病情從而達(dá)到治療腫瘤的目的。下面是ctDNA相關(guān)檢測技術(shù)各自特點介紹。

2.1 Sanger法1977年 Sanger等［26］首先用于噬菌體x174的基因測定，在被科學(xué)家稱作 “登月計劃”的人類基因組計劃 （human genome project，HGP）中Sanger法發(fā)揮了重要作用。該法利用了雙脫氧鏈終止的原理。Beaver等［27］通過對29例早期乳腺癌患者的腫瘤組織和血漿的PIK3CA進行研究，檢測到腫瘤組織與血漿中的突變，對患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險的評估、指導(dǎo)患者的化療具有重要意義。Sanger法具有檢測明確、成本低、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點，但通量低也限制其無法滿足當(dāng)前的高通量測序的需要。

2.2 NGS新一代測序技術(shù)。通過平行測序、邊合成邊測序的思想。測序的大致流程包括：DNA文庫的構(gòu)建、文庫分子克隆擴增、測序及分析。以高通量、高靈敏度、高精確度等優(yōu)勢在ctDNA中檢測多個已知或未知突變而廣泛應(yīng)用，F(xiàn)orshew等［28］通過對卵巢癌患者的TP53、EGFR、KRAS的檢測，這種高通量的方法可以作為一種無創(chuàng)的 “液體活檢”方式，方便分析ctDNA，用于個體化癌癥基因組學(xué)的研究。Narayan等［29］對非小細(xì)胞肺癌的研究，NGS可以作為一個實際的診斷測試的基礎(chǔ)來測量血液中來源于腫瘤的DNA水平。

2.3 ARMS-PCR擴增阻滯突變系統(tǒng)。是在PCR的基礎(chǔ)上建立起來的［30］，利用PCR與凝膠電泳可以檢測DNA的點突變。引物的3′端堿基與模板的堿基如果不互補，一般的耐熱DNA聚合酶則無法進行延伸，ARMS-PCR就是根據(jù)已知點突變來設(shè)計3條引物，3′端堿基會分別與正常和突變的模板堿基互補配對，從而將有點突變的模板與正常模板區(qū)別出來。因其操作簡便、用時較短、成本低等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于各種基因的多態(tài)性研究。Board等［31］研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA的突變在76例乳腺癌的血清與腫瘤組織的一致性為95%，PIK3CA可以作為一種預(yù)測性生物標(biāo)志物。

2.4 數(shù)字PCR該技術(shù)的出現(xiàn)在ctDNA的研究中發(fā)揮了重要作用，相較于普通的PCR，數(shù)字PCR能夠直接計數(shù)DNA的個數(shù)，實現(xiàn)對樣本的絕對定量。尤其適用于Ct值不能很好發(fā)揮的領(lǐng)域。微滴式數(shù)字PCR，利用陰性體系與陽性體系的數(shù)量，泊松分布的原理，計算出目的片段的絕對拷貝數(shù)［32］。在進行傳統(tǒng)的PCR擴增前需對樣本進行相應(yīng)的微滴化處理，通過油包水結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)20 000個均一的微滴，每個微滴都是獨立的體系。PCR擴增后對每個微滴進行檢測，有熒光的標(biāo)記為1，反之則為0，可以得到 靶 分 子 的 濃 度 和 拷 貝 數(shù) 。 Hindson等［33］在analytical chemistry雜志上發(fā)表了微滴式數(shù)字PCR在DNA拷貝絕對定量的應(yīng)用，具有里程碑的意義，使得該技術(shù)在ctDNA的研究中更加規(guī)范化。Bettegowda等［16］評估 640例不同類型癌癥患者，發(fā)現(xiàn)不同疾病的檢測率不同，卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等檢測率比腎癌、腦癌、甲狀腺癌、前列腺癌要高一些，在對其中206例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者研究中，檢測ctDNA中的KRAS突變敏感性（87.2%）、特異性（99.2%），這些都表明ctDNA是一種廣泛適用、特異性和敏感性的生物標(biāo)志物。

表1 ctDNA相關(guān)檢測技術(shù)介紹

2.5 BEAMing數(shù)字PCR與流式技術(shù)的結(jié)合，特異性PCR引物擴增完目標(biāo)突變區(qū)域后，與磁珠（帶有特異PCR引物）混合后進行油包水結(jié)構(gòu)的擴增反應(yīng)，利用帶顏色的熒光探針結(jié)合磁珠上的特異PCR產(chǎn)物，再用流式細(xì)胞儀分析磁珠的顏色從而確定突變的情況。Diehl等［24］對18例結(jié)腸癌患者中192份血漿樣本ctDNA突變情況進行分析，檢測靈敏度可達(dá)0.005%。

2.6 其他檢測技術(shù)在ctDNA的研究中，實時熒光定量 PCR也被應(yīng)用［34］。此外質(zhì)譜法，通過離子飛行時間的判讀，測出其分子質(zhì)量。用于ctDNA的最大優(yōu)勢是準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強、重復(fù)性好、速度快、樣本標(biāo)準(zhǔn)化處理。對基因突變、基因分型、DNA甲基化、基因表達(dá)、單倍體序列差異、拷貝數(shù)變異等多項檢測與分析［35］。 TAM-Seq，用特異性引物進行循環(huán)目標(biāo)區(qū)域的預(yù)擴增，再利用不同特性的接頭標(biāo)簽繼續(xù)第二次擴增。雙向重復(fù)測序提高了測序的精度，高突變頻率、高敏感性、高特異性、低成本都有利于臨床應(yīng)用［36］。 CAPP-Seq，用定制化的突變位點庫做“篩選器”，相應(yīng)的樣本進行靶向捕獲然后進行深度測序，用于ctDNA的研究靈敏度及特異性更強，價位合適［28］。

3 ctDNA的臨床應(yīng)用

現(xiàn)在腫瘤診斷面臨的問題是早期診斷比較困難，患者往往錯過最佳治療時機；放化療產(chǎn)生藥物耐藥性，缺乏有效的治療靶點；易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差等。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，實時檢測、靶向用藥、個體化診療是提高腫瘤遠(yuǎn)期生存率降低病死率的關(guān)鍵。目前，ctDNA作為一種廣泛應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志，可以用于腫瘤患者早期診斷，腫瘤發(fā)展過程檢測、判斷預(yù)后、個性化指導(dǎo)用藥?，F(xiàn)今關(guān)于ctDNA的應(yīng)用研究日益增多。

3.1 早期診斷及腫瘤發(fā)展過程檢測對于腫瘤患者來說，傳統(tǒng)的影像學(xué)、病理檢測等往往都是疾病發(fā)展的晚期，不能夠早期及時診斷，是延誤腫瘤治愈的主要原因。cfDNA是腫瘤負(fù)荷的反應(yīng)，腫瘤患者血漿中的含量要明顯高于非腫瘤患者，對其進行定量檢測并且與ctDNA體細(xì)胞突變結(jié)合，能夠更好地提供有效信息。對孕婦血液檢驗，進行無創(chuàng)唐氏篩查，確定患兒疾病的風(fēng)險，這是液態(tài)活檢臨床最常用的方法。在一項對不同單基因風(fēng)險的孕婦血液樣本的檢測中，正確區(qū)分受累和未受累的妊娠，并且在第一周就檢測出第一個受累的妊娠。胎兒分?jǐn)?shù)低至3.7%［37］。這對疾病的早期診斷、疾病管理、減少并發(fā)癥具有重要意義。胰管腺癌（PDAC）是最常見的惡性腫瘤，發(fā)現(xiàn)后往往預(yù)后很差，對52例胰管腺癌術(shù)前血漿凝固酶敏感蛋白-2（THBS2）、CA19-9進行測定，ctDNA進行定量分析。Logistic分析發(fā)現(xiàn)將CA19-9、THBS2及cfDNA三者結(jié)合統(tǒng)計值增加到了0.94。這種組合為早期胰管腺癌的早期無創(chuàng)診斷奠定了基礎(chǔ)［38］。 Zhang 等［39］對卵巢癌、卵巢囊腫及健康患者的血液樣本進行對照，發(fā)現(xiàn)ALU-219濃度和ALU-219/ALU-115比值可以作為卵巢癌的診斷標(biāo)志物，血漿ALU水平的檢測可以單獨或者聯(lián)合應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷，此外還可采用可重復(fù)的方法實時監(jiān)測腫瘤在疾病進展過程中的演變。

3.2 判斷預(yù)后在一項對155例肝癌患者手術(shù)切除的研究，胰島素樣生長結(jié)合蛋白-7（IGFBP7）甲基化組要明顯高于非甲基化組，Kalian-Meier曲線表明，IGFBP7甲基化與總生存率顯著相關(guān)（P＜0.001），且IGFBP-7甲基化是肝癌肝切除術(shù)后和早期腫瘤復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子（P=0.008）［40］。 Soliman 等［41］在非小細(xì)胞肺癌 （NSCLC）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、健康患者血漿中 ALU-215、ALU-247及cfDNA含量進行研究，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的含量明顯高于后兩者，血清中cfDNA在NSCLC無創(chuàng)血液篩查中有很好的應(yīng)用前景，且cfDNA升高與患者的預(yù)后相關(guān)。Lee等［42］利用 5736例乳腺癌血液中ctDNA 進行液態(tài)活檢，TP53、ESR1、PIK3CA 的突變頻率分別為38%、32%、27%。ctDNA突變可以預(yù)測疾病復(fù)發(fā)和不良的預(yù)后。Bernard等［43］對34例患者123份血液樣本進行外顯子和ctDNA的縱向分析，包括COX回歸、Fisher檢驗、Bayesian推斷，將外顯子和ctDNA的KRAS突變與預(yù)后聯(lián)系在一起，顯示外顯子和ctDNA水平的升高與疾病的進展顯著相關(guān)（P＜0.003），外顯子和ctDNA的使用提供了與治療相關(guān)的預(yù)測和預(yù)后信息。

3.3 個性化指導(dǎo)用藥通過對酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療的EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌的研究，治療后患者EGFR突變狀態(tài)顯著改變，治療后突變狀態(tài)的改變可以指導(dǎo)臨床醫(yī)師進行個性化用藥［44］。最近在術(shù)后監(jiān)測下對結(jié)直腸癌患者的研究表明ctDNA復(fù)發(fā)的證據(jù)可能發(fā)生在臨床檢測前幾個月，ctDNA的另一個可能作用是進一步評估CEA或CT不能夠確定的結(jié)果，能夠更早地診斷出來從而有利于對患者及時用藥。對45例結(jié)直腸癌血液樣本的評估中，有14例（31%）檢測到了ctDNA，在兩年的隨訪中，21例患者 （47%）出現(xiàn)復(fù)發(fā)，檢測到的ctDNA與較低的無復(fù)發(fā)生存率相關(guān) （HR 4.85，P＜0.01），對于不確定的結(jié)腸癌患者，ctDNA的分析是有必要的，早期發(fā)現(xiàn)有利于早期個體化治療［45］。一項對于轉(zhuǎn)移性前列腺癌的液態(tài)活檢中，53例患者在治療過程中檢測ctDNA，經(jīng)短期（中位數(shù)22d）雄激素剝奪治療（ADT）后，患者的ctDNA和DNA的中位數(shù)分別為 11%（0～84%）和 1.0%（0～51%），在 47%和21%的隊列中，TP53突變和DNA修復(fù)效果分別被識別，配對樣本一致檢測率為80%［46］。ctDNA能夠提供患者的突變信息，將其與原發(fā)組織結(jié)合是評估分子亞型的最佳方法，有助于個體化精準(zhǔn)醫(yī)療下對患者的靶向治療。

總之，伴隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的不斷闡明，影響腫瘤調(diào)控的內(nèi)外環(huán)境因素及耐藥機制等不斷研究，ctDNA在腫瘤檢測領(lǐng)域的運用受到越來越多的重視。ctDNA以方便、實時、侵害性小和鑒別診斷能力強等優(yōu)勢，可以對腫瘤的演化和適應(yīng)性改變以及藥物治療效果進行實時監(jiān)控，從而更能有效指導(dǎo)臨床對腫瘤早期診斷、檢測發(fā)展過程、判斷預(yù)后及個體化用藥。但是ctDNA數(shù)量少、需要擴增、對檢測方法的靈敏性要求高，相信在不久的將來隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷發(fā)展，液態(tài)活檢在各種疾病中的不斷應(yīng)用，ctDNA將以其獨特的方式，在未來腫瘤的檢測實踐中嶄露頭角。