氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定五福心腦清軟膠囊中冰片含量

楊曉玲，郝 福，侯金才*

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.京津冀聯(lián)創(chuàng)藥物研究(北京)有限公司，北京100083)

五福心腦清軟膠囊是以傳統(tǒng)活血化瘀中藥紅花的果實(shí)中提取的精制紅花油為主藥，輔以芳香開(kāi)竅的冰片及維生素E、維生素B6組成的以中藥為主的中西藥復(fù)合制劑，具有活血散瘀、通經(jīng)止痛、開(kāi)竅醒神之功效。臨床用于瘀血阻滯所致的中風(fēng)、中經(jīng)絡(luò)、半身不遂、口眼歪斜、胸痹心痛、腦梗死、冠心病、心絞痛及高血脂癥見(jiàn)上述證候者[1-4]。收載于國(guó)家藥品中藥標(biāo)準(zhǔn)(經(jīng)絡(luò)肢體 腦系分冊(cè))，原標(biāo)準(zhǔn)只有冰片鑒別，本研究建立氣相色譜法[5]測(cè)定五福心腦清軟膠囊中冰片含量，并根據(jù)ICH等相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果該方法專(zhuān)屬、精密、準(zhǔn)確，可以作為五福心腦清軟膠囊的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PE Clarus580氣相色譜儀(鉑金埃爾默)，DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm；安捷倫)；MS-105DU型分析天平(梅特勒)；

1.2 試藥

五福心腦清軟膠囊(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為16090731、16090732、16090733)；龍腦對(duì)照品(食品藥品檢定研究院，批號(hào)110881-201508)；內(nèi)標(biāo)物：水楊酸甲酯(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110707-201413)；異龍腦對(duì)照品(南通飛宇生物公司，批號(hào)FY-GA01)；冰片原料(四川青神康華制藥有限公司，批號(hào)160308)；試劑：無(wú)水乙醇(色譜純，天津賽孚瑞)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm)；載氣為氮?dú)?；流速?.5 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；分流比10：1；起始柱溫為130 ℃，保持11 min，以20 ℃·min-1的速度升溫至220 ℃，保持30 min；采用FID檢測(cè)器，溫度為250 ℃；氫氣流量45 mL·min-1，空氣流量450 mL·min-1；進(jìn)樣體積為1 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 取水楊酸甲酯適量，精密稱(chēng)定，加無(wú)水乙醇制成每1 mL約含7.5 mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取龍腦對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇適量使溶解，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為100%對(duì)照品溶液，保持內(nèi)標(biāo)溶液加入量不變，依法配制80%、120%對(duì)照品溶液[6]。

2.2.3 供試品溶液 取五福心腦清適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取約2.5 g，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇適量使溶解，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照儲(chǔ)備液 取精制紅花油38 g，維生素E 1.64 g與維生素B62.0 g置同一密封容器中，超聲混合均勻，備用。

2.2.5 異龍腦定位溶液 取異龍腦對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為異龍腦定位溶液。

2.2.6 冰片原料溶液 取冰片原料約100 mg，精密稱(chēng)定，置20 mL量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為冰片原料溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證[7-11]

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，精密吸取3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，每個(gè)濃度平行進(jìn)樣2次。結(jié)果平均校正因子為0.68，RSD=0.68%，系統(tǒng)適用性良好。

2.3.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 1倍陰性對(duì)照溶液：取陰性對(duì)照儲(chǔ)備液約2.48 g，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，充分搖勻，即得；3倍陰性對(duì)照溶液：取陰性對(duì)照儲(chǔ)備液約7.44 g，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，充分搖勻，即得；內(nèi)標(biāo)溶液：按“2.2.1”制備方法操作；對(duì)照品溶液：按“2.2.2”100%濃度制備方法操作；異龍腦溶液：按“2.2.5” 制備方法操作；冰片原料溶液：按“2.2.6” 制備方法操作；供試品溶液：按“2.2.3” 制備方法操作。精密吸取上述溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)圖譜

續(xù)圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)圖譜

由圖譜信息可知，在龍腦與水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)色譜峰位置處，不含冰片的陰性對(duì)照均無(wú)色譜峰出現(xiàn)。由此表明其他物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，該方法專(zhuān)屬性良好。

2.3.3 線性與范圍試驗(yàn) ①取龍腦對(duì)照品40 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為200%龍腦儲(chǔ)備液；②取水楊酸甲酯120 mg，精密稱(chēng)定，置20 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；③線性溶液的配制：分別精密量取200%對(duì)照品儲(chǔ)備液5、8、15 mL分別置于3個(gè)20 mL量瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液2 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度搖勻，作為50%、80%、150%的線性溶液，分別精密量取200%對(duì)照品儲(chǔ)備液5、6 mL分別置于2個(gè)10 mL量瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度搖勻，作為100%、120%的線性溶液。

精密吸取上述線性溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。以龍腦對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)(x)，以龍腦對(duì)照品的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為：y=2.515 9x-0.009 5(r=0.999 9)，結(jié)果表明在0.19～0.58 mg· mL-1范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

2.3.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 將對(duì)照品溶液與供試品溶液分別于0、4、8、12、18、24 h，精密吸取各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與0小時(shí)的測(cè)定結(jié)果相比，相對(duì)平均偏差均<3.0%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 甲乙兩人分別各自配制6份供試品溶液在不同時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果12份供試品溶液RSD=0.64%(n=12)，精密度良好。

2.3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) ①50%濃度溶液：取龍腦對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，與陰性對(duì)照儲(chǔ)備液約4.96 g置同一50 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇適量使溶解，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液4 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為50%濃度水平溶液；②100%濃度溶液：取龍腦對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，與陰性對(duì)照儲(chǔ)備液約2.48 g置同一25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇適量使溶解，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為100%濃度水平溶液；③150%濃度溶液：取龍腦對(duì)照品15 mg，精密稱(chēng)定，與陰性對(duì)照儲(chǔ)備液約2.48 g置同一25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇適量使溶解，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，充分搖勻，作為150%濃度水平溶液。每個(gè)濃度水平平行配制3份。

精密吸取上述50%、100%、150%濃度溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。平均回收率為97.44%，RSD=0.64%，結(jié)果表明，本方法具有良好的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率結(jié)果

2.3.7 耐用性試驗(yàn) 通過(guò)改變載氣流速±0.1 mL/min，初始溫度±5 ℃。結(jié)果表明，色譜條件作微小變動(dòng)，測(cè)定結(jié)果基本不受影響，保持一致，表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

按“2.2.3”方法制備3批供試品溶液后，進(jìn)行測(cè)定，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品分析結(jié)果

3 討論

3.1 冰片含量測(cè)定依據(jù)

根據(jù)國(guó)內(nèi)復(fù)方中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定指導(dǎo)原則[12]，處方中如果含有揮發(fā)性成分，如冰片、樟腦、揮發(fā)油時(shí)，應(yīng)對(duì)易揮發(fā)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，規(guī)定含量范圍?？刂埔讚]發(fā)性成分的含量，有利于控制制劑質(zhì)量，保證制劑的療效。

冰片對(duì)照品是人工合成的，由龍腦和異龍腦組成。在本試驗(yàn)條件下，五福心腦清軟膠囊的色譜峰中冰片也是兩個(gè)峰，通過(guò)比較保留時(shí)間，可以確定為龍腦和異龍腦，因此該藥中冰片為合成冰片[13-14]，最終我們建立了本品種冰片含量測(cè)定方法，以龍腦成分來(lái)計(jì)。

3.2 樣品溶劑確定

統(tǒng)計(jì)藥典[15]收載冰片測(cè)定品種所用溶劑，有環(huán)己烷、三氯甲烷、石油醚、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯等，不統(tǒng)一?；诰G色環(huán)保檢測(cè)方法的考慮，我們選擇用無(wú)水乙醇作為溶劑。從測(cè)定結(jié)果可以看出，無(wú)水乙醇可以完全溶解五福心腦清軟膠囊內(nèi)容物，準(zhǔn)確性良好。

3.3 內(nèi)標(biāo)物選擇

經(jīng)相關(guān)藥典[15]品種的查閱發(fā)現(xiàn)，測(cè)定冰片方法均為氣相色譜法，采用的定量方法基本為內(nèi)標(biāo)法。一般而言，內(nèi)標(biāo)法可以避免系統(tǒng)帶來(lái)的誤差，相對(duì)外標(biāo)法更為準(zhǔn)確，所以本品冰片的檢測(cè)方法定為內(nèi)標(biāo)法。

內(nèi)標(biāo)物的合適性尤其關(guān)鍵，內(nèi)標(biāo)物選擇的一般原則：內(nèi)標(biāo)物應(yīng)與待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)相近，在色譜圖中內(nèi)標(biāo)物在待測(cè)物附近出峰；樣品中不存在內(nèi)標(biāo)物，且內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物分離完全；內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是純物質(zhì)；內(nèi)標(biāo)物與樣品互溶，且不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[16]。

在色譜圖中水楊酸甲酯在龍腦附近出峰；通過(guò)專(zhuān)屬性試驗(yàn)可知，樣品中不存在內(nèi)標(biāo)物，且水楊酸甲酯與龍腦分離完全；水楊酸甲酯穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)品易得；水楊酸甲酯與樣品互溶。水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，穩(wěn)定性較好，不受其他因素的影響，校正因子結(jié)果均維持在精確的范圍內(nèi)(0.68±0.01)，所以選擇其為內(nèi)標(biāo)物結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.4 色譜方法確定

①色譜柱選擇：統(tǒng)計(jì)藥典[15]收載冰片測(cè)定品種發(fā)現(xiàn)，色譜柱為毛細(xì)管色譜柱，類(lèi)型均為聚乙二醇20000(PEG-20M)，我們最終選擇了DB-WAX柱(30 m×320 μm，0.50 μm)，該色譜柱具有高效性，分離效果好。②柱溫的選擇[17]：冰片中含有龍腦和異龍腦兩種同分異構(gòu)體成分，二者性質(zhì)相似，本實(shí)驗(yàn)以龍腦為特征峰，對(duì)洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化(加入了升溫程序)，結(jié)果在最佳色譜條件下，既保證了龍腦峰與異龍腦峰有較好的分離度，又保證龍腦和內(nèi)標(biāo)峰有較好的峰型和適宜的保留時(shí)間，排除了復(fù)方中其他成分及基質(zhì)對(duì)于冰片中龍腦含量測(cè)定結(jié)果的干擾，最終采用程序升溫法。

綜上所述，本試驗(yàn)中采用氣相色譜法測(cè)定五福心腦清軟膠囊中冰片含量，經(jīng)方法學(xué)研究顯示，該方法專(zhuān)屬、準(zhǔn)確，可用于本品含量測(cè)定，為該藥品提供了有效的質(zhì)量控制方法。