HPLC法測(cè)定平糖散中五味子甲素、五味子乙素含量

鄧麗瑩

(阜新市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 阜新 123000)

平糖散為遼寧省阜新市糖尿病醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由五味子、山藥、肉桂及枸杞子四味中藥組成，具有養(yǎng)陰生津、溫腎補(bǔ)腎的功效，主治口渴多飲、口燥咽干、多食以饑、小便頻數(shù)、腰痠腿軟、頭暈氣短、疲乏無(wú)力、夜寐困難等癥狀。方中五味子為君藥，性溫，味酸、甘，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)五味子可應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)類(lèi)疾病的治療。除此之外，其還有降血糖、肝保護(hù)、抗糖尿病慢性并發(fā)癥、增強(qiáng)免疫功能等作用。五味子所含有的五味子甲素、五味子乙素是平糖散的主要有效成分。目前該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未進(jìn)行含量測(cè)定質(zhì)量控制, 故本文采用高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定五味子甲素和五味子乙素兩種成分的含量。建立的測(cè)定方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性良好，適用于平糖散的質(zhì)量控制，為進(jìn)一步提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters e2489檢測(cè)器，Waters工作站)；BP211D 型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 試藥

五味子甲素對(duì)照品(批號(hào)0764-200006)、五味子乙素對(duì)照品(批號(hào)110765-200306)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；平糖散(遼寧省阜新市糖尿病醫(yī)院提供，批號(hào)：20170907、20170910、20171015、20180312，規(guī)格：4 g/袋)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(72∶28)；檢測(cè)波長(zhǎng)∶254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。理論塔板數(shù)以五味子甲素峰計(jì)算不少于2 000。色譜見(jiàn)圖1。

1：五味子甲素(Deoxyschizandrin)；2：五味子乙素(Schisandrin B)

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取五味子甲素對(duì)照品4.47 mg，置于50 mL量瓶中，五味子乙素2.74 mg，置于25 mL量瓶中，分別加入甲醇至刻度，搖勻，即得五味子甲素對(duì)照品溶液(0.089 4 mg·mL-1) ，五味子乙素對(duì)照品溶液( 0.109 6 mg·mL-1) 。精密移取五味子甲素對(duì)照品溶液13 mL，五味子乙素對(duì)照品溶液10 mL于同一50 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取平糖散3袋，研細(xì)，取2.0 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按平糖散處方比例及制法，制得不含五味子的陰性樣品，取不含五味子的陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 將對(duì)照品溶液與供試品溶液及陰性對(duì)照溶液用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖(色譜圖見(jiàn)圖1)。五味子甲素與五味子乙素均能達(dá)到基線(xiàn)分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照的溶液1 mL、2 mL、5 mL、8 mL、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程為：五味子甲素Y=3 848 754.912 4X-20 101.387 8，R2=1.000 0；五味子乙素Y=3 104 070.15X-59 413.360 5，R2=1.000 0。結(jié)果表明，五味子甲素和五味子乙素在0.023 244～0.232 44 μg·mL-1和0.021 92～0.219 2 μg.mL-1濃度范圍內(nèi)與其各自的峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3 精密度考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定五味子甲素與五味子乙素的峰面積，結(jié)果五味子甲素與五味子乙素峰面積的RSD(n=6)分別為0.8%和1.2%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)平糖散(批號(hào)20170907)供試品6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定五味子甲素和五味子乙素的含量，結(jié)果五味子甲素與五味子乙素的平均含量為0.195 4 mg·g-1和0.553 3 mg·g-1，RSD(n=6) 分別為1.2%和0.6%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：20170907) 20 μL，分別于配制 0、2、4、8、16、24 h 后進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD(n=6)分別為0.7%、0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的同一批次( 批號(hào)：20170907) 樣品6份，每份約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入五味子甲素和五味子乙素濃度為7.75 μg·mL-1和21.92 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液25 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算2種成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取平糖散樣品3批，按照“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按上述色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)得峰面積，計(jì)算五味子甲素和五味子乙素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (mg·g-1，n=3 )

3 討論

五味子為平糖散的主要成分之一。已有大量研究表明，五味子具有顯著的保肝利肝作用[2]。筆者針對(duì)平糖散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中五味子含量測(cè)定的空白，建立了HPLC同時(shí)測(cè)定平糖散中五味子兩種有效成分的方法，為平糖散的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

在供試品溶液的制備中，考察以甲醇、乙醇為溶劑，超聲處理15、20、30、60 min以及加熱回流30 min、1 h的提取條件，結(jié)果表明，以甲醇為溶劑，加熱回流1 h時(shí)待測(cè)成分可提取完全，且操作簡(jiǎn)單。

對(duì)于流動(dòng)相的選擇，參考有關(guān)文獻(xiàn)，考察了甲醇-水、乙腈-水體系，其中甲醇-水(72∶28)對(duì)五味子甲素和五味子乙素的分離效果較好，在檢定波長(zhǎng)處基線(xiàn)無(wú)干擾。高效液相色譜法測(cè)定中，分別考察了220 nm、236 nm、250 nm、254 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果表明，選用254 nm分離效果較為理想，無(wú)雜質(zhì)干擾。

采用建立的方法測(cè)定了3批平糖散，結(jié)果表明，不同批次樣品中五味子甲素和五味子乙素的含量存在差異，這可能與原料五味子的品質(zhì)有關(guān)。五味子作為平糖散的重要有效成分，應(yīng)保證其原料質(zhì)量的穩(wěn)定性，更應(yīng)確保平糖散中五味子含量的穩(wěn)定性，建議在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加五味子甲素和五味子乙素的含量測(cè)定，以反映五味子的含量，使平糖散的質(zhì)量得到全面控制。