高效液相色譜法測(cè)定清肺止咳散中黃芩苷含量

朱育紅，朱 弘

（陜西省獸藥監(jiān)測(cè)所，西安710016）

清肺止咳散收載于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部，是由桑白皮、知母、苦杏仁、前胡、金銀花、連翹、桔梗、甘草、橘紅、黃芩十味藥材經(jīng)粉碎、混合而制成的中藥散劑，具有清瀉肺熱，化痰止痛的功能，主治肺熱咳嗽，咽喉腫痛。現(xiàn)廣泛應(yīng)用于畜禽咳喘病的治療，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定方法。為了更好地控制其質(zhì)量，參考文獻(xiàn)方法，研究建立了采用反相高效液相法測(cè)定清肺止咳散中黃芩苷的含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1．1 儀器 PerkinElmer 液相色譜儀，Waters 液相色譜儀，UV 檢測(cè)器，WatersC18 柱、 安捷倫C18 柱、PerkinElmer C18 柱；Sartorius Cp225D 分析天平。

1．2 試藥與試劑 黃芩苷對(duì)照品分別來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)為110715-201720，標(biāo)示含量為93．5%）和中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（批號(hào)為Z0271109，Z0271705 標(biāo)示含量分別為98．8%、96．8%）。

清肺止咳散樣品，共10 批，其中實(shí)驗(yàn)室自制小樣1 批（樣品編號(hào)1）；哈爾濱摩天農(nóng)科獸藥有限公司3 批，批號(hào)分別20180514、20180515、20180516（樣品編號(hào)2-4）；河北遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司3批，批號(hào)分別3GN180201、3GN180202、3GN180203（樣品編號(hào)5-7）；河南環(huán)通制藥有限公司3 批，批號(hào)分別20160308、20180311、20180524（樣品編號(hào)8-10）。

清肺止咳散缺黃芩的陰性樣品，按處方及制法制成缺黃芩的陰性樣。制備小樣、缺黃芩的陰性樣的藥材均購(gòu)自西安怡康大藥房。

甲醇Fisher Chemical（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，色譜純，批號(hào)：178337 等）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部“清解合劑”中黃芩含量測(cè)定方法。流動(dòng)相：甲醇-0．3%磷酸溶液（55 ∶45）；流速：1．0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5～10 μL［1］。

2．2 溶液的制備

2．2．1 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇少許超聲使溶解，加50%甲醇稀釋?zhuān)瑩u勻，制得黃芩苷對(duì)照品溶液（每1 mL 含黃芩苷0．1 mg）［2］。

2．2．2 供試品溶液的制備 取實(shí)驗(yàn)室自制清肺止咳散小樣1．0 g，精密稱(chēng)定，置100 mL 量瓶中，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，放至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得［2］。

2．2．3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺黃芩陰性樣1．0 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液［2］。

2．2．4 小樣測(cè)試結(jié)果 按照2．1 色譜條件，采用外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算，實(shí)驗(yàn)室自制小樣每1g 含黃芩苷13．07 mg，13．13 mg，平均值為13．1 mg。

2．3 系統(tǒng)適用性和專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密量取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10、5 μL，注入液相色譜儀，按2．1 項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果理論塔板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)算為6374（圖1-1）、7865（圖1-2）；供試品色譜圖中黃芩苷峰與臨峰分離良好，與前峰分離度為7．0（圖2-1），與后峰分離度為2．0（圖2-2）；陰性對(duì)照色譜在與對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰（圖3-1，3-2）。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測(cè)要求；處方中其他成分對(duì)黃芩定量檢測(cè)無(wú)干擾，專(zhuān)屬性也能滿足檢測(cè)要求［1］。

圖1-1 黃芩苷對(duì)照品色譜圖（進(jìn)樣量10 μL，Waters C18 柱，理論塔板數(shù)6374）Fig 1-1 Chromatogram of the Baicalin reference substance（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18，Theoretical plate number：6374）

圖1-2 黃芩苷對(duì)照品色譜圖（進(jìn)樣量5 μL，PE C18 柱，理論塔板數(shù)7865）Fig 1-2 Chromatogram of the Baicalin reference substance（Injection volume，5 μL，Column：PE C18，Theoretical plate number：7856）

圖2-1 供試品色譜圖（進(jìn)樣量10μL，Waters C18 柱）Fig 2-1 chromatogram of the test sample（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18）

圖2-2 供試品色譜圖（進(jìn)樣量5 μL，PE C18 柱）Fig 2-2 chromatogram of the test sample（Injection volume，5 μL，Column：PE C18）

2．4 線性關(guān)系考察 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇少許超聲使溶解，加50%甲醇稀釋?zhuān)瞥擅? mL 含黃芩苷0．379 mg 的對(duì)照品貯備液。取貯備液，分別精密吸取1、2、5 mL，置100 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成①、②、③號(hào)溶液，濃度分別為3．8、7．6、19．0 μg／mL，再分別精密吸取黃芩苷對(duì)照品貯備液5、10、20 mL，置50 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成④、⑤、⑥號(hào)溶液，濃度分別為38、76、152 g／mL，以黃芩苷對(duì)照品貯備液作為⑦號(hào)溶液，濃度0．379 mg／mL，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝16412x-25735，R2＝0．9998（n＝7），黃芩苷在3．8～379 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（見(jiàn)圖4、圖5）。

圖3-1 缺黃芩苷的陰性樣品色譜圖（ 進(jìn)樣量10 μL，Waters C18 柱）Fig 3-1 Negative chromatogram of baicalin（Injection volume，10 μL，Column：Waters C18）

圖3-2 缺黃芩苷的陰性樣品色譜圖 進(jìn)樣量5 μL，PE C18 柱Fig 3-2 Negative chromatogram of baicalin（Injection volume，5 μL，Column：PE C18）

圖4 黃芩苷線性試驗(yàn)色譜峰綜合圖Fig 4 Baicalin linear test chromatogram

2．5 準(zhǔn)確度 采用加樣回收的方法［1］

2．5．1 黃芩苷對(duì)照品母液制備 取黃芩苷對(duì)照品（Z0271705，標(biāo)示含量96．8%）57．5 mg，置200 mL 量瓶中，加20 mL 甲醇超聲處理30 分鐘使溶解，放至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，制成母液A。

2．5．2 對(duì)照品溶液制備 取母液A 3．00 mL，加50%甲醇稀釋至10．00 mL 即得。

2．5．3 樣品制備 取樣品2、樣品7 各3 份，精密稱(chēng)定，置100 mL 容量瓶中，精密加入黃芩苷母液A 25 mL，按2．2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，上機(jī)測(cè)定，黃芩苷的回收率在92．9%～95．3%之間，平均回收率為94．3%，RSD為0．92%，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖5 黃芩苷線性圖Fig 5 Baicalin linear graph

表1 加樣回收率試驗(yàn)Tab 1 Recovries of Baicalin in preparation

2．6 精密度 重復(fù)性 取8 號(hào)樣品（批號(hào)為20160308），按2．2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制成供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定黃芩苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0．21%，結(jié)果見(jiàn)表2［1］。

表2 精密度試驗(yàn)Tab 2 Precision test

2．7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取4 號(hào)樣品（批號(hào)為20180516），按2．2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制成供試品溶液，立即測(cè)定，再在2、4、8、12、24 h 的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，測(cè)定值在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為1．96%，結(jié)果見(jiàn)表3［1］。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab 3 Stability test

2．8 耐用性［1］

2．8．1 色譜柱、進(jìn)樣量的耐用性 取清肺止咳散（9號(hào)樣品，批號(hào)為20180311），按2．2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得樣品溶液，按2．1 項(xiàng)下色譜條件，分別在PE 液相色譜儀上用waters 柱、安捷倫柱、PE柱，在waters 液相色譜儀上用waters 柱，進(jìn)樣測(cè)試含量，進(jìn)樣量分別為5、10 μL，結(jié)果RSD分別為1．72%、1．12%。結(jié)果見(jiàn)表4。

2．8．2 流速的耐用性 取清肺止咳散（10 號(hào)樣品，批號(hào)為20180524），按2．2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得樣品溶液，按2．1 項(xiàng)下色譜條件，保持流動(dòng)相比例不變，于0．8 mL／min 和1．2 mL／min 流速條件下進(jìn)樣5 μL 進(jìn)行測(cè)試。二者測(cè)試結(jié)果相對(duì)偏差為0．71%，結(jié)果見(jiàn)表4。

2．8．3 流動(dòng)相的耐用性 取清肺止咳散（10 號(hào)樣品，批號(hào)為20180524），按2．2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得樣品溶液，將2．1 項(xiàng)下色譜條件中流動(dòng)相比例調(diào)為50：50，其余保持不變，進(jìn)樣5 μL，進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果與原流動(dòng)相比例測(cè)得結(jié)果相對(duì)偏差為0．0%。耐用性試驗(yàn)結(jié)果表明該方法能夠耐受不同液相色譜儀，色譜柱，在進(jìn)樣量、流速、流動(dòng)相比例等因素小范圍變化情況下，測(cè)定清肺止咳散中黃芩苷的含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明耐用性良好。

2．9 樣品含量測(cè)定 取三家企業(yè)產(chǎn)品，每家三批共9 批樣品，分別按2．2 項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL，上機(jī)測(cè)定峰面積，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 耐用性試驗(yàn)Tab 4 Serviceability test

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 5 Content determination results （n=2）

3 討論與結(jié)論

3．1 含量測(cè)定成分的選擇 清肺止咳散現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部，是由桑白皮、知母、黃芩等十味藥材經(jīng)粉碎、混合而制成的中藥散劑，處方量320 g，其中黃芩45 g，占14．06%，為君藥。黃芩的主要成分為黃芩苷，具有顯著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降膽固醇、抗血栓形成、緩解哮喘、瀉火解毒、止血、安胎、抗變態(tài)反應(yīng)及解痙作用，也為哺乳動(dòng)物肝臟涎酶的特異性抑制劑，具有調(diào)節(jié)某些疾病的作用，也具有較強(qiáng)的抗癌反應(yīng)生理效能。黃芩苷分子式為C21H18O11分子量（446）適中，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適于作為含量測(cè)定目標(biāo)成分［3］。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定方法，為了更好地控制其質(zhì)量，擬定采用HPLC 測(cè)定黃芩苷的含量，并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了系統(tǒng)的考察，該方法操作簡(jiǎn)便，黃芩苷在3．8～379 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法準(zhǔn)確度、精密度、日內(nèi)穩(wěn)定性和耐用性均能達(dá)到檢測(cè)要求。

3．2 樣品前處理方法的選擇 黃芩苷是一種黃酮類(lèi)化合物，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑。參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部銀黃提取物口服液含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，本試驗(yàn)采用先用少量甲醇超聲提取，再用50%甲醇稀釋?zhuān)Y(jié)果證明該方法能夠較為完全地提取出清肺止咳散中的黃芩苷，并且陰性無(wú)干擾。

3．3 含量測(cè)定限度的確定 擬定為每1 g 清肺止咳散中含黃芩以黃芩苷計(jì)不得低于10．0 mg。黃芩藥材收載于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部，其含量限度規(guī)定為不得少于9．0%。實(shí)驗(yàn)室自制小樣所用黃芩藥材中黃芩苷含量為9．7%，折合到清肺止咳散中，理論上應(yīng)為13．6 mg／g，實(shí)測(cè)值為13．1 mg／g，黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為96%?？紤]到大生產(chǎn)實(shí)際，按轉(zhuǎn)移率80%、黃芩藥材中黃芩苷含量不低于9．0%計(jì)算，每1 g 肺止咳散中含黃芩苷應(yīng)不得少于10．1 mg，取整數(shù)為10．0 mg。擬以此作為含量測(cè)定的限度。生產(chǎn)企業(yè)提供的9 批樣品中，6 批含量超出此限度，3 批未達(dá)到此限度。因黃芩苷實(shí)際無(wú)毒，上限未作規(guī)定［1］［2］。

3．4 結(jié)論 用高效液相法測(cè)定清肺止咳散中黃芩苷的含量，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，靈敏度高，回收率好，可有效控制該制劑中主藥黃芩的含量，含量限度暫定為每1 g 清肺止咳散中含黃芩以黃芩苷計(jì)不得低于10．0 mg［5］。