黃芪多糖注射液生物活性檢測方法的分析與評價

元雪湞，馬發(fā)順，段沙沙，王軍紅，王小艷，李華岑，劉占通，周紅霞，吳志明?

（1．河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州450000；2．安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽455000）

黃芪多糖是從傳統(tǒng)中藥黃芪中提取的有效成分，研究表明，黃芪多糖不僅可以促進(jìn)動物免疫器官的發(fā)育，增加免疫細(xì)胞的數(shù)量，而且還能提高免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)疫苗的免疫效果，從而起到提高自身免疫力、抵抗致病微生物侵襲的作用［1-3］。李朝輝等研究表明，在1日齡雛雞日糧中添加黃芪多糖可以有效促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，提高外周血中免疫球蛋白含量和T 淋巴細(xì)胞數(shù)量［4］。閆春賢在黃芪多糖對ROSS308 肉仔雞生長的影響實驗中發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對體重增加不太明顯，對免疫器官的增重前期有降低，后期有明顯增重［5］。徐端紅等在研究中同樣發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以增強(qiáng)斷奶羔羊的免疫球蛋白的水平，提高抗病能力［6］。宣小龍在黃芪多糖提高干奶期奶牛乳腺免疫力的研究中發(fā)現(xiàn)，使用黃芪多糖可以提高干奶期奶牛乳腺免疫力能達(dá)到很好效果，并且對干奶期前的預(yù)防效果也很好［7］。高揚在研究中表明，飼料中添加不同水平的黃芪多糖，可以不同程度地提高脾臟系數(shù)［8］。在養(yǎng)殖業(yè)中將黃芪多糖作為飼料添加劑，可提高畜禽免疫力、促進(jìn)飼料吸收利用，并提高畜產(chǎn)品質(zhì)量［9］。侯曉礁等研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠后期母豬飼料中添加黃芪多糖粉，可以有效提高妊娠母豬的窩均產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)和窩均活仔質(zhì)量［10］。然而，對于黃芪多糖的質(zhì)量檢測方面的研究相對較少，過去主要側(cè)重于含量的測定以及性狀鑒別上。2013年《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品、中藥卷）》第一冊首次將黃芪多糖生物活性檢測列為商品化黃芪多糖注射液的檢驗項目，《中國獸藥典2015 版（二部）》首次將其生物活性檢測納入黃芪多糖注射液的必檢項目。目前，關(guān)于黃芪多糖注射液生物活性檢測方面的報道很少，特別是對其方法的分析與評價還未見報道。本試驗采用《中國獸藥典2015 版（二部）》提供的方法，對河南省4 家獸藥廠提供的黃芪多糖樣品進(jìn)行了生物活性檢測，并增加了胸腺項目檢測作為參考；對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計處理，對黃芪多糖生物活性現(xiàn)實檢測方法進(jìn)行分析和評價，期望為今后黃芪多糖注射液生物活性檢測方法的應(yīng)用與改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗動物 昆明鼠，SPF 級，體重18～20 g，雌雄各半，質(zhì)量合格證號為：NO．41003100005184，購自河南省實驗動物中心；SPF 級全價飼料，購自河南省實驗動物中心。屏障環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度24～25 ℃，相對濕度40%～50%；墊料每周更換3次，提供充足的無菌飲水。

1．1．2 試驗儀器和藥品 精密分析天平（AB204-N），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；一次性使用無菌注射器（型號1mL），河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；4 種黃芪多糖樣品，規(guī)格：以葡萄糖（C6H12O6）計10 mL ∶0．1 g，由河南省各獸藥廠提供；生理鹽水，河南科倫藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1．2 方法

1．2．1 試驗設(shè)計 本試驗選用4 種黃芪多糖樣品（A、B、C、D），每種樣品各自獨立進(jìn)行試驗設(shè)計，均設(shè)試驗組和對照組。在對每一種樣品進(jìn)行檢測試驗時，選擇16 只體重相近的昆明鼠，將其隨機(jī)分為2 組，每組8 只，一組為試驗組，另一組為對照組，整個試驗共用昆明鼠64 只。4 個試驗組分別用4 種黃芪多糖樣品處理，每天每只腹腔注射黃芪多糖0．5 mL，連續(xù)注射7 d；4 個對照組每只昆明鼠注射等量的生理鹽水。

1．2．2 脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的計算 最后一次注射黃芪多糖注射液24h 后處死昆明鼠，依次稱量每只昆明鼠的體重、脾臟重和胸腺重，并計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾指數(shù)＝脾臟重（mg）／體重（g）；胸腺指數(shù)＝胸腺重（mg）／體重（g）。再進(jìn)一步采用簡單算術(shù)平均法計算各組的平均脾指數(shù)和平均胸腺指數(shù)。按照《中國獸藥典2015 版（二部）》提供的方法判定樣品是否合格，即：試驗組與對照組平均脾指數(shù)之差大于或等于2 為合格，小于2 為不合格。

1．2．3 統(tǒng)計分析方法 試驗組與對照組間各項目的顯著性檢驗采用t檢驗法；胸腺重與脾臟重之間、兩種指數(shù)之間的相關(guān)性分析采用相關(guān)系數(shù)法，4種樣品間的差異顯著性檢驗采用單因素方差分析法，多重比較采用Duncan 新復(fù)極差法。

1．2．4 所用軟件 使用Excel2010 軟件進(jìn)行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計、t 檢驗和相關(guān)系數(shù)計算；使用DPS7．05 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。文中P＜0．05 用?表示，P＜0．01 用??表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 4 種黃芪多糖樣品生物活性檢測結(jié)果 4 種黃芪多糖樣品生物活性檢測結(jié)果見表1。4 種樣品試驗組與對照組兩指數(shù)的差值見表2?？梢耘袛喑鰳悠稢 和D 為生物活性檢測合格樣品，而A 和B為生物活性不合格樣品。從胸腺指數(shù)的表現(xiàn)來看，樣品A、B 的差值為負(fù)值，樣品C、D 的差值均為正值。進(jìn)一步計算出4 種樣品脾臟指數(shù)的差值與胸腺指數(shù)的差值間的相關(guān)系數(shù)為0．9494（P＜0．05）。

2．2 胸腺重與脾臟重及兩種指數(shù)之間的相關(guān)性對4 個樣品試驗組和對照組的脾臟重和胸腺重及兩種指數(shù)間分別進(jìn)行相關(guān)分析結(jié)果見表3?？梢?，無論試驗組還是對照組脾臟重和胸腺重之間相關(guān)性均較弱，但對照組無論兩器官重間還是兩指數(shù)間均存在負(fù)相關(guān)傾向，而試驗組兩器官重間和兩種指數(shù)間均呈正相關(guān)。

2．3 試驗組與對照組的對比分析 從各檢測項目試驗組與對照組的t檢驗結(jié)果來看，體重方面，除了樣品C 差異極顯著外，其余3 種樣品均差異不顯著（P＞0．05）；脾重和脾指數(shù)方面，4 種樣品大多表現(xiàn)出顯著（P＜0．05）或極顯著（P＜0．01）的差異；胸腺重和胸腺指數(shù)方面，差異均不顯著（P＞0．05），但樣品A、B 的統(tǒng)計量t值為負(fù)值，而合格樣品C、D的t值為正值。

2．4 4 種樣品間的對比分析 方差分析顯示，對照組胸腺重差異不顯著（P＞0．05），試驗組體重和對照組胸腺指數(shù)兩項差異顯著（P＜0．05），其余各項均差異極顯著（P＜0．01）。4 種樣品間各測定項目的比較結(jié)果見表4和表5?？梢钥闯鯟 樣品的對照組體重最大，且與其它3 種樣品的對照組有極顯著差異，對照組的脾臟重和脾指數(shù)都是B 樣品最大，與樣品C、D 間無顯著差異（P＞0．05），而與樣品A 間有極顯著差異（P＜0．01）。試驗組樣品D 的各項指標(biāo)均排在首位，樣品A 的各項指標(biāo)均排在最后，且二者之間有極顯著差異（P＜0．01）。按照《中國獸藥典2015 版（二部）》標(biāo)準(zhǔn)判斷，樣品D、C 合格，樣品B、A 不合格，但樣品B、A 也具有一定的生物活性。合格樣品C、D 間在體重、脾重和脾指數(shù)方面均差異不顯著（P＞0．05），而在胸腺重和胸腺指數(shù)兩方面差異顯著（P＜0．05）。

3 討論與結(jié)論

黃芪多糖具有促進(jìn)動物生長的作用，并含未知生長因子（UGF）可顯著提高畜禽的生長速度，促進(jìn)脾臟發(fā)育，提升機(jī)體抵抗力，這些在本試驗中得到部分證實［4，11］。

表1 4 種黃芪多糖樣品生物活性檢測結(jié)果Tab 1 Results of 4 Astragalus polysaccharide samples＇bioactivity

表2 4 種黃芪多糖樣品兩種指數(shù)試驗組與對照組的均值之差Tab 2 Mean difference of Astragalus polysaccharide samples＇two index between test groups and control groups

表3 脾臟重與胸腺重及兩種指數(shù)間的相關(guān)系數(shù)Tab 3 Correlation coefficient among spleen weight ，thymus weight and two indexes

表4 4 種黃芪多糖樣品試驗組間各測定項目的比較結(jié)果Tab 4 Comparison results of test item among the four sample test groups

表5 4 種黃芪多糖樣品的對照組間各測定項目的比較結(jié)果Tab 5 Comparison results of test item among the four sample control groups

試驗結(jié)果表明，黃芪多糖對脾臟的發(fā)育具有促進(jìn)作用，這一點與閆春賢和高陽的研究結(jié)果相一致［5，8］，而對胸腺的促進(jìn)作用不明顯或具有延緩胸腺退化的作用，并且脾臟指數(shù)的差值和胸腺指數(shù)的差值間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這說明在進(jìn)行黃芪多糖生物活性檢測時，胸腺指數(shù)具有一定的參考價值，具體標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步研究確定。另外，脾指數(shù)可靈敏反映出黃芪多糖的生物活性，而胸腺指數(shù)反映不靈敏。試驗組樣品B 在體重、胸腺重和胸腺指數(shù)方面的良好表現(xiàn)，可能與樣品本身的質(zhì)量及試驗誤差有關(guān)，4 種樣品間存在差異性，這可能與各廠家生產(chǎn)黃芪多糖的工藝不同、黃芪多糖樣品的質(zhì)量差異有關(guān)。

對照組間各測定項目上均有差異性，可能是由于試驗條件的限制和動物福利要求，減少了試驗動物使用數(shù)量，在試驗動物選擇和分組環(huán)節(jié)未能很好的控制試驗誤差，對昆明鼠的日齡、性別等因素沒有足夠重視，再加上昆明鼠本身會存在一定的個體差異，這可能是各對照組間測定項目均有不同程度差異的重要因素。

在實際操作方面，《中國獸藥典2015 版（二部）》提供的檢測方法具有可操作性。從解剖的角度來說，脾臟相較于其它臟器更易摘取。此外，本試驗運用《中國獸藥典2015 版（二部）》提供的方法對河南省4 家獸藥廠提供的黃芪多糖樣品進(jìn)行生物活性檢測，檢測出了2 個生物活性合格樣品和2 個生物活性不合格樣品，進(jìn)一步證實了該方法的可行性。

使用《中國獸藥典2015 版（二部）》提供的方法，對4 種黃芪多糖樣品進(jìn)行生物活性檢測，結(jié)果是2 個樣品合格2 個樣品不合格。黃芪多糖有促進(jìn)昆明鼠脾臟生長發(fā)育的作用，或可減緩其胸腺退化的進(jìn)程。脾重和胸腺重之間、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)之間均存在弱的正相關(guān)關(guān)系。脾指數(shù)能靈敏反映黃芪多糖的生物活性，用脾指數(shù)作為黃芪多糖生物活性檢測指標(biāo)是可行的。胸腺指數(shù)、脾指數(shù)在試驗組與對照組的差值之間存在正相關(guān)關(guān)系，胸腺指數(shù)可以作為黃芪多糖生物活性檢測的參考指標(biāo)。