合歡磁牡口服液提取工藝研究

羅永祥許加娟胡智鵬

（1．湖南圣雅凱院士工作站，湖南湘潭411228；2．湖南圣雅凱生物科技有限公司，湖南湘潭411228）

近年來，我國家禽集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖發(fā)展迅速，但各種應(yīng)激因素對家禽造成的危害卻并沒有得到解決，如免疫接種、轉(zhuǎn)群換料以及長途運輸?shù)人碌膽?yīng)激刺激是不可避免的。由此造成家禽生長緩慢，采食量降低，飼料轉(zhuǎn)化率下降，更甚者導(dǎo)致機體免疫功能下降，傳染病流行。如今，越來越多研究將中藥復(fù)方制劑和應(yīng)激聯(lián)系起來，中藥復(fù)方制劑也逐漸替代西藥應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中［1］。合歡磁牡口服液是由合歡皮、磁石和牡蠣經(jīng)一定工藝制成，用于緩解家禽抗應(yīng)急反應(yīng)的一個純中藥制劑，其中，合歡皮解郁安神做君藥，磁石、牡蠣鎮(zhèn)心安神輔佐合歡皮鎮(zhèn)靜安神。三藥合用，經(jīng)口服，藥物直接作用于脾胃、腸道，并經(jīng)胃腸道吸收，可有效緩解應(yīng)激原所引起的躁動不安，心神不寧等應(yīng)激反應(yīng)，避免家禽許多潛在疾病的發(fā)生［2-3］。因此，最佳的提取工藝是有效控制合歡磁牡口服液產(chǎn)品質(zhì)量的重要保證。

1 材料與方法

1．1 藥物 合歡皮、磁石、牡蠣均購于湖南湘眾醫(yī)藥有限公司，合歡磁牡口服液由湖南圣雅凱生物科技有限公司制備。

1．2 對照品與試劑 （-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（C33H44O17）購自中國食品藥品檢定研究院，供含量用，批號：111911-201603；乙腈，色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1．3 主要儀器與設(shè)備 水環(huán)式真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京；電子天平（日本島津AUW220D）；高效液相6000 LDI PUMP（美國）檢測器型號：紫外；色譜柱：Uranus，C18 5 μm 4．6 mm×250 mm；色譜條件：18／82 乙腈／0．04%磷酸溶液；多功能提取罐購自湖南衡陽中一藥品機械有限公司；真空濃縮罐購自浙江溫州森博輕工機械有限公司；口服液配制罐購自浙江溫州標(biāo)新機械有限公司；口服液灌裝機購自湖南長沙中和藥品機械有限公司。

1．4 方法

1．4．1 組方 合歡皮500 g、磁石250 g、牡蠣250 g，制成1000 mL。即每毫升含1 g 原生藥材。

1．4．2 水提工藝的研究 C33H44O17為合歡皮主要成分，故以測定C33H44O17含量為考察指標(biāo)，用正交設(shè)計法篩選加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)等工藝條件。采用L9（34）進行正交試驗［4-5］。因素水平安排見表1：

表1 L9（34）正交試驗因素水平Tab 1 Level of L9（34） Orthogonal Experimental Factors

1．4．3 濃縮工藝的研究 提取按確定的生產(chǎn)工藝，濃縮采用單因素工藝研究，故選擇在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃（控制適宜的真空度）工藝條件下各濃縮3 批次至相對密度為1．04～1．06（60-70 ℃），加防腐劑羥苯甲脂+羥苯丙脂（9 ∶1）適量，加純化水配制成合歡磁牡口服液，每批平行測定C33H44O17含量［6］，求得平均值和RSD，考察濃縮溫度對合歡磁牡口服液C33H44O17含量的影響。

1．4．4 提取工藝驗證試驗［7-8］按最佳工藝連續(xù)生產(chǎn)10 批，以C33H44O17含量為考察項目。制定合歡磁牡口服液C33H44O17含量指標(biāo)。

1．5 統(tǒng)計分析 使用Excel 數(shù)據(jù)庫記錄數(shù)據(jù)，并使用SPSS19．0 分析軟件（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）進行統(tǒng)計分析。顯著性水平為P＜0．05或P＜0．01。

2 結(jié)果與分析

2．1 提取工藝正交試驗 由表2極差R 的數(shù)據(jù)分析可知：各因素的影響程度依次為C＞A＞B，即煎煮次數(shù)＞加水倍數(shù)＞煎煮時間。由表3方差分析結(jié)果表明：影響因素煎煮次數(shù)C 對產(chǎn)品中C33H44O17含量有顯著影響（P＜0．01），煎煮次數(shù)為C3 時C33H44O17含量最高；煎煮時間B 和加水量A 對產(chǎn)品中C33H44O17含量無顯著影響（P＞0．05）。

2．2 濃縮工藝研究 表4結(jié)果顯示，不同的濃縮溫度對合歡磁牡口服液中C33H44O17含量的無顯著影響（P＞0．05）。

表2 合歡磁牡口服液提取工藝正交試驗及結(jié)果Tab 2 Orthogonal experimental and results of extraction process of Hehuacimu oral liquid

表3 正交試驗方差分析Tab 3 Variance analysis of orthogonal experiment

表4 不同濃縮溫度對合歡磁牡口服液含量的影響Tab 4 Effects of different concentrated temperature on the content of Hehuacimu oral liquid

2．3 水提取工藝驗證 根據(jù)以上提取和濃縮工藝的試驗研究結(jié)果，最終采用加8 倍量的水，煎煮時間1 h，煎煮3 次，真空濃縮的工藝進行水提取工藝驗證試驗。結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，采用該工藝提取的C33H44O17的轉(zhuǎn)移率平均值為72．37%，RSD為0．83%，對C33H44O17含量無顯著影響（P＞0．05）。

表5 水提取工藝驗證試驗結(jié)果Tab 5 Verification experimental results of water extraction process

3 討論與結(jié)論

《神農(nóng)本草經(jīng)》描述合歡皮作用：“主安五臟，和心志，令人歡樂無憂?！敝嗅t(yī)藥理論將合歡皮歸為安神藥物，現(xiàn)代藥物書籍將合歡皮歸類安神藥。合歡皮為合歡磁牡口服液方中君藥，其主要成分為三萜皂苷、生物堿、黃酮類、木脂素和多糖等多類化學(xué)成分［9］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，水溶性的木脂素類成分為合歡皮解憂安神作用的主要活性成分［10］。夏潔等人［11］研究結(jié)果顯示，通過活性篩選實驗，發(fā)現(xiàn)合歡皮的安神作用與合歡皮中具有鎮(zhèn)靜功能的活性成份木脂素類化合物有關(guān)，其中木脂素苷的含量最高。《中國獸藥典》2015年版中合歡皮項下的含量測定以C33H44O17為質(zhì)量考察指標(biāo)。故本次試驗選擇C33H44O17含量測定作為產(chǎn)品質(zhì)量考察指標(biāo)。

木脂素是由苯丙素氧化聚合而成的一類化合物。多數(shù)呈游離狀態(tài)，游離的木脂素親脂性強，水溶性差。從分子結(jié)構(gòu)上分析C33H44O17中連接了吡喃葡萄糖苷結(jié)構(gòu)，由于葡萄糖是多羥基醛單糖，木脂素苷類水溶性大大增強，C33H44O17易溶于水，水是易得且價格低廉的溶劑，故選擇水作溶劑。本水提取工藝試驗結(jié)果表明，影響因素煎煮次數(shù)對合歡磁牡口服液的提取工藝影響顯著，選擇煎煮3 次時，C33H44O17的含量顯著升高，因此最佳參數(shù)為煎煮3 次；加水量和煎煮時間對提取工藝的影響不顯著，但從經(jīng)濟角度考慮，選擇加8 倍量的水，煎煮1 h。不同的濃縮溫度對合歡磁牡口服液含量的影響無顯著差異。然而，考慮到真空濃縮過程中藥物處于密閉設(shè)備中，無外界污染風(fēng)險，故將濃縮工藝確定為真空濃縮。采用本試驗總結(jié)出的此最佳工藝C33H44O17的轉(zhuǎn)移率平均值為72．37%，RSD為0．83%，對10 個批次的C33H44O17含量影響的差異不顯著，提示此工藝的重現(xiàn)性較好，工藝穩(wěn)定。

合歡磁牡口服液標(biāo)準(zhǔn)草案中含量測定規(guī)定：合歡磁牡口服液每毫升含合歡皮以C33H44O17計，不得低于140 μg。此含量是依照《中國獸藥典》2015年版合歡皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和道地藥材合歡皮企業(yè)內(nèi)控技術(shù)要求，且結(jié)合本工藝活性成分C33H44O17轉(zhuǎn)移率制定。這也提示合歡磁牡口服液中標(biāo)準(zhǔn)C33H44O17含量定量基本合理。本試驗水提取工藝驗證結(jié)果顯示，10 個批次的產(chǎn)品中每毫升含合歡皮以C33H44O17計的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于140 μg，證明本工藝質(zhì)量可控，為制定標(biāo)準(zhǔn)定量指標(biāo)提供可靠依據(jù)，建議在取得新獸藥證書及生產(chǎn)批件后，收集道地藥材合歡皮C33H44O17含量數(shù)據(jù)，制定更高的合歡皮企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，為提升產(chǎn)品質(zhì)量內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

合歡磁牡口服液中C33H44O17含量的檢測結(jié)果在前后試驗中出現(xiàn)一定偏差，主要是由于不同產(chǎn)地的合歡皮中C33H44O17含量差距較大。通過數(shù)據(jù)分析得出，2017年試驗結(jié)果顯示C33H44O17轉(zhuǎn)移率為71．96%，與之前的轉(zhuǎn)移率72．37%比較，偏差較小。這也表明了此提取合歡磁牡口服液的工藝重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定的優(yōu)點。

磁石為鎮(zhèn)靜安神類礦物性中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代中醫(yī)文獻記載，磁石“主周痹風(fēng)濕、肢節(jié)腫痛、通關(guān)節(jié)、消痛腫、明目聰耳、止金瘡血、治金瘡腫毒、斂汗止血。”。其系主含四氧化三鐵，具有聰耳明目，潛陽納氣和鎮(zhèn)靜安神的作用，用于治療頭暈?zāi)垦！⒛I虛氣喘等證。牡蠣也首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，書中將其列為上品。其中記有“牡蠣，味咸平，主傷寒寒熱，溫瘧灑灑，驚恚怒氣，除拘緩鼠瘺，女子帶下赤白，久服，強骨節(jié)，殺邪氣，延年?！敝翝h代，張仲景所著《傷寒論》和《金匱要略》就已經(jīng)廣泛的使用牡蠣組成方劑來治療疾病。兩書中涉及到配伍牡蠣的方劑就達11 個之多，主要口服湯劑給藥?！吨袊F藥典》和《中國獸藥典獸藥使用指南》中藥卷均有收載［12-13］。以上著作都不同程度上體現(xiàn)了牡蠣在中醫(yī)臨床上的重要的地位。近代研究還表明，牡蠣可以調(diào)節(jié)人體免疫水平，可降血脂和血壓。我們曾對磁石和牡蠣成分的提取進行研究，結(jié)果不理想，有待進一步研究。