汽化吸入PFC對肺損傷豬腎上皮細胞凋亡的影響

秦鑫　秦蕾　劉又寧

【摘要】 目的 通過對肺灌洗造成小豬肺損傷模型行全氟化碳（PFC）汽化吸入， 了解其對肺損傷小豬腎小管上皮細胞凋亡的影響。方法 取健康小豬20只， 隨機分為VMV組（PFC汽化吸入， 10只）、CMV組（常規(guī)機械通氣， 8只）和假手術(shù)組（2只）。取各組腎皮髓交界處腎臟組織， 采用電鏡觀察凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)， DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法（TUNEL）法檢測細胞凋亡指數(shù)， 免疫組織化學(xué)法測定凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）、bcl-2相關(guān)X蛋白（BAX）蛋白的表達， 半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測定BAX、bcl-2核糖核酸（mRNA）表達。結(jié)果 TUNEL結(jié)果：腎的陽性細胞主要分布在近端腎小管， 腎小球未見凋亡細胞。VMV組細胞凋亡率為（20.2±2.9）%， 明顯低于CMV組的（80.2±4.8）%， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.868， P=0.000<0.05）。腎BAX、bcl-2蛋白表達結(jié)果：VMV組的腎BAX蛋白表達（12.6±6.8）明顯低于CMV組的（62.2±3.6）， bcl-2蛋白表達（36.8±2.1）明顯高于CMV組的（6.2±2.3）， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。腎BAX、bcl-2 mRNA表達結(jié)果：VMV組的腎BAX mRNA表達（7.10±0.32）明顯低于CMV組的（9.29±1.06）， bcl-2 mRNA表達（10.29±2.51）， 明顯高于CMV組的（5.18±1.08）， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.230、5.350， P<0.05）。假手術(shù)組細胞凋亡數(shù)極少， BAX、bcl-2表達均很低。結(jié)論 汽化吸入PFC可減少急性肺損傷小豬腎小管上皮細胞凋亡， 其作用機制可能與抑制BAX基因的蛋白表達及升高bcl-2基因表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 全氟化碳;急性肺損傷;凋亡;機械通氣;腎臟

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.17.108

Effect of vaporization inhalation of PFC on apoptosis of renal tubular epithelial cells in pigs with lung injury? ?QIN Xin， QIN Lei， LIU You-ning. Department of Respiratory Medicine， Second Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

【Abstract】 Objective? ?To understand the effect of vaporization inhalation of perfluorocarbon （PFC） for model of pig lung injury caused by lung lavage on apoptosis of renal tubular epithelial cells in lung injury. Methods? ?A total of 20 healthy pigs were randomly divided into VMV group （vaporization inhalation of PFC，

10 pigs）， CMV group （conventional mechanical ventilation， 8 pigs） and sham operation group （2 pigs）. Kidney tissue at the junction of renal cortex and medulla was taken from each group. Ultrastructure of apoptotic cells was observed by electron microscopy， apoptotic index was detected by terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling（TUNEL）， expression of apoptotic genes B cell lymphoma/leukemia-2 （bcl-2） and bcl-2 related X protein （BAX） was determined by immunohistochemistry， and expression of BAX and Bcl-2 ribonucleic acid （mRNA） was determined by Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results? ?TUNEL results： The positive cells of the kidney were mainly distributed in the proximal tubules， and no apoptotic cells were found in the glomeruli. VMV group had obviously lower apoptosis rate as （20.2±2.9）% than （80.2±4.8）% in CMV group， and the difference was statistically significant （t=32.868， P=0.000<0.05）. Renal BAX， bcl-2 protein expression results： VMV group had obviously lower BAX protein expression as （12.6±6.8） than （62.2±3.6） in CMV group， and obviously higher bcl-2 protein expression as （36.8±2.1） than （6.2±2.3） in CMV group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Renal BAX and bcl-2 mRNA expression results：VMV group had obviously lower BAX mRNA expression as （7.10±0.32） than （9.29±1.06） in CMV group， and obviously higher bcl-2 mRNA expression as （10.29±2.51） than （5.18±1.08） in CMV group. Their difference was statistically significant （t=6.230， 5.350， P<0.05）. The apoptotic cells in sham operation group were very few and the expressions of BAX and Bcl-2 were very low. Conclusion? ?Vaporized inhalation of PFC can reduce the apoptosis of renal tubular epithelial cells in piglets with acute lung injury. Its mechanism may be related to inhibiting the expression of BAX gene and increasing the expression of Bcl-2 gene.

【Key words】 Perfluorocarbon; Acute lung injury; Apoptosis; Mechanical ventilation; Kidney

急性腎功能衰竭在急性肺損傷所致多器官功能障礙綜合征（MODS）中占據(jù)著重要地位， 其使MODS患者的死亡率達到88%。腎細胞凋亡是急性腎功能衰竭的早期表現(xiàn)。本研究通過對行機械通氣肺損傷小豬汽化吸入PFC治療， 以了解機械通氣肺損傷后腎小管上皮細胞凋亡及PFC汽化吸入對腎小管上皮細胞的保護?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 選取健康小豬20只（購于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）， 平均體重（4.5±0.5）kg， 隨機分為3組：①VMV組10只， 機械通氣[容量控制， 潮氣量（Vt）：8 ml;呼吸頻率（f）：30次/min;吸入氧濃度（FiO2）=50%;吸呼比（I∶E）=1∶1]， 應(yīng)用濕化罐裝置加熱蒸發(fā)， 經(jīng)呼吸機管路給予PFC汽化吸入2 h， 并于治療后機械通氣6 h;② CMV組8只， 給予常規(guī)機械通氣（參數(shù)同前）8 h;③假手術(shù)組2只， 只打開腹腔， 取出腎臟， 作為正常對照。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 模型制備 應(yīng)用鹽酸氛氨酮25 mg和鹽酸二甲苯胺噻嗪（商品名：麻保靜注射液）4 mg混合后對小豬行基礎(chǔ)麻醉， 戊巴比妥鈉（20 mg/kg）行靜脈全身麻醉（全麻）。氣管切開插管連接呼吸機。行頸總動脈和頸總靜脈插管， 采用多功能監(jiān)護儀壓力傳感器監(jiān)測動脈血壓， 采集動脈血氣標(biāo)本并取血。頸總靜脈插管連接三通橋， 測定中心靜脈壓， 連接林格液及注射藥物。動物模型應(yīng)用十六烷磺基丁二酸鈉鹽按照

2 mg/kg的劑量、1∶1比例配制生理鹽水和無水乙醇溶解后氣管內(nèi)注入， 然后反復(fù)改變豬體位使藥物能夠均勻地分布在肺內(nèi)各葉， 以此制作急性肺損傷動物模型。

1. 2. 2 汽化治療方法 VMV組動物急性肺損傷模型制作成功開始治療時， 迅速用裝有等量PFC的同型號濕化罐替換連接于呼吸機管路中的濕化罐， 同時將濕化加熱溫度調(diào)至3檔（PFC液體溫度47～49℃， 呼吸機管路Y型口處溫度37～38℃）， 即可開始汽化吸入治療。兩組動物均于6 h機械通氣過程中， 監(jiān)測動脈血氣、血液動力學(xué)、呼吸力學(xué)指標(biāo)， 汽化吸入治療2、8 h時抽動脈血3 ml， 離心取血漿。6 h常規(guī)機械通氣結(jié)束后， 處死實驗動物， 打開腹腔， 取出皮髓交界處腎臟數(shù)小塊， 分別置于10%福爾馬林和液氮凍存管保存。

1. 2. 3 檢測方法 取各組腎皮髓交界處腎臟組織， 采用電鏡觀察凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)， TUNEL法檢測細胞凋亡指數(shù)， 免疫組織化學(xué)法測定凋亡基因BAX、bcl-2蛋白的表達， RT-PCR法測定BAX、bcl-2 mRNA表達。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 TUNEL結(jié)果 腎的陽性細胞主要分布在近端腎小管， 腎小球未見凋亡細胞。CMV組見腎小管上皮細胞凋亡， 核染色質(zhì)濃縮、邊聚呈環(huán)狀， 或核固縮、碎裂呈不規(guī)則球塊， 細胞質(zhì)高度腫脹， 或溶解， 或致密度增加， 周圍淋巴細胞浸潤。VMV組腎小管上皮細胞的凋亡減輕， 凋亡率明顯降低。VMV組細胞凋亡率為（20.2±2.9）%， 明顯低于CMV組的（80.2±4.8）%， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.868， P=0.000<0.05）。

2. 2 腎BAX、bcl-2蛋白表達結(jié)果 VMV組的腎BAX蛋白表達（36.8±2.1）明顯低于CMV組的（62.2±3.6）， bcl-2蛋白表達（12.6±6.8）明顯高于CMV組的（6.2±2.3）， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2. 3 腎BAX、bcl-2 mRNA表達結(jié)果 VMV組的腎BAX mRNA表達（7.10±0.32）明顯低于CMV組的（9.29±1.06）， bcl-2 mRNA表達（10.29±2.51）明顯高于CMV組的（5.18±1.08）， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.230、5.350， P<0.05）。

2. 4 假手術(shù)組情況 假手術(shù)組凋亡細胞極少， BAX、bcl-2表達均很低， 只作為對照參考。

3 討論

MODS是急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的主要死亡原因， 死亡率高達60%～98%[1]。而目前治療ARDS的基本方法是機械通氣， 由于機械通氣是正壓通氣， 與人體的負壓通氣不同， 因此其本身在治療肺損傷的同時亦可加重肺損傷[2]。有研究表明， 保護性通氣的策略可減少MODS， 降低ARDS的死亡率[3]。然而， 經(jīng)機械通氣治療的ARDS患者發(fā)生MODS的機制及保護性通氣策略如何降低其死亡率尚不清楚。

腎臟是MODS中最早出現(xiàn)損傷的臟器之一， 一旦發(fā)生腎功能衰竭， MODS的死亡率將大大增加。腎小管上皮細胞的凋亡是腎功能失調(diào)的早期表現(xiàn)[4]， 對腎功能衰竭早期診斷提供預(yù)警指標(biāo)， 并對判斷預(yù)后提供依據(jù)。腎小管上皮細胞的凋亡可造成小管液回漏、基底膜裸露、轉(zhuǎn)運功能喪失等功能障礙， 成為少尿、無尿等病理生理改變的基礎(chǔ)， 在腎功能的損害過程中發(fā)揮著無法估量的作用[5]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)， 肺損傷的小豬模型經(jīng)機械通氣干預(yù)后， 腎小管上皮細胞發(fā)生凋亡， CMV組較假手術(shù)組凋亡率有明顯增加趨勢。

PFC是碳氫化合物中氫原子被氟原子取代后形成的一類化合物， 醫(yī)學(xué)上常用的PFC碳原子為6～12個， 常溫下是無色、無味、無毒的透明液體， 密度高， 表面張力低， 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定， 在體內(nèi)不發(fā)生代謝， 粘度高于水而低于血液， 不溶于水、血液、脂類及其他介質(zhì)。PFC有良好的氣體運載能力， 對氧的溶解釋放在10 ms內(nèi)完成， 且過程可逆， 比人血紅蛋白所需的30 ms快得多， 其對二氧化碳的溶解釋放時間更短， 僅為4 ms， 且過程可逆。因此PFC作為機械通氣時運送氧和二氧化碳的載體， 衍生出PFC霧化、PFC汽化通氣、部分及全液體通氣等機械通氣方式[6]。有研究證明， 汽化通氣改善肺功能方面亦有顯著效果[7]。研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)機械通氣后， 腎小管上皮細胞凋亡程度明顯增加， 故推斷機械通氣的ARDS患者發(fā)生MODS， 可能與腎小管上皮細胞凋亡增加有關(guān)， 而經(jīng)汽化通氣后， 腎小管上皮細胞凋亡程度降低， 也證實了這一推斷。PFC通過以下途徑降低腎小管上皮細胞的凋亡：①通過改善肺的呼吸功能， 增加血氧飽和度， 糾正腎小管上皮細胞缺氧。因為急性肺損傷時， 缺氧使腎臟致密斑細胞肥大， 并合成、分泌腎素， 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活來抑制致密斑細胞， 促使其凋亡[8];②通過改善肺通氣/血流， 減輕肺毛細血管損傷， 減少血管緊張素轉(zhuǎn)換酶釋放， 進而通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素軸影響腎血管的血流;③通過提高動脈血氧分壓， 因為急性肺損傷時血液中氧含量低， 腎皮質(zhì)髓質(zhì)血流重新分布， 髓質(zhì)血流減少， 血管緊張素Ⅱ在髓質(zhì)中的密度是皮質(zhì)的4～5倍， 促使髓質(zhì)細胞凋亡;④穩(wěn)定細胞膜及抑制呼吸道炎性因子、細菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生釋放入血， 抑制細菌生長繁殖， 引起腎小管上皮細胞的損傷;⑤影響凋亡調(diào)節(jié)基因表達， 從而影響腎小管上皮細胞凋亡。

綜上所述， 機械通氣肺損傷小豬腎小管上皮細胞凋亡增高， 存在BAX過表達;經(jīng)PFC汽化吸入后的BAX表達降低， 抗凋亡因子bcl-2表達增加， 亦說明BAX、bcl-2在其整個凋亡調(diào)節(jié)過程中起著不可估量的作用。

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[收稿日期：2018-11-23]