大黃蟲丸對頸動脈粥樣硬化家兔頸動脈狹窄程度、血脂指標(biāo)及斑塊的影響研究

方永軍，胡亞莉，范小璇，蘭楊，徐澤彪，周鋒，胡珍淵，韋鵬方

頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）是一種慢性進(jìn)展性炎性病理過程，以頸動脈管壁增厚變硬、彈性消失及管腔縮小為主要特點(diǎn)，其發(fā)病過程包括脂質(zhì)氧化沉積、炎性細(xì)胞遷移、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌增殖等多個環(huán)節(jié)［1］。頸動脈粥樣硬化斑塊形成是頸動脈狹窄的主要危險因素之一，易損斑塊脫落可導(dǎo)致腦血管急性閉塞，可嚴(yán)重威脅患者生命安全，目前CAS治療以調(diào)脂、抗血小板聚集、抗氧化及鈣拮抗劑等為主要原則［2］。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，動脈粥樣硬化（AS）的主要病機(jī)為瘀、痰、濕、毒，多由肝、脾、腎等臟腑功能失調(diào)所致。吳以嶺院士認(rèn)為，AS由痰、瘀、毒阻滯損傷脈絡(luò)所致［3］。國醫(yī)大師張學(xué)文認(rèn)為，痰濁阻于脈絡(luò)，氣機(jī)不利，久則瘀血內(nèi)生，痰瘀膠結(jié)，留于頸部脈道，最終導(dǎo)致頸動脈粥樣硬化斑塊形成［4］。大黃蟲丸是破血逐瘀之峻劑，由（熟）大黃、黃芩、（生）地黃、蟲、水蛭、蠐螬、虻蟲、桃仁、杏仁、芍藥、干漆、甘草12味中藥提煉而成，具有祛瘀血、清瘀熱、滋陰血、潤燥結(jié)等功效。近年研究表明，大黃蟲丸治療腦出血、腦梗死、高脂血癥、CAS的效果較好［5］。目前，大黃蟲丸治療CAS的具體作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究旨在探討大黃蟲丸對CAS家兔頸動脈狹窄程度、血脂指標(biāo)及斑塊的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2017年11月—2018年1月完成。選取3～4月齡的同批次健康日本大耳白兔40只，雌雄各20只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，均購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心〔動物許可證號：SCXK（陜）2014-003〕。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 普通顆粒飼料（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），高脂飼料按膽固醇2%+花生油6%+普通顆粒飼料92%的比例加工配制，大黃蟲丸（西安正大制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z61021089），阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20051408），3%戊巴比妥，0.9%氯化鈉溶液，碘伏，75%醫(yī)用酒精，10%甲醛，碘海醇，注射用青霉素鈉（80萬U，哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H23021439），肝素鈉注射液（天津生物化學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H12020505），三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2.2 主要儀器 兔臺，電子秤（萬佳利 ACS-30，產(chǎn)品編號：324795），精密電子秤〔塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)〕，4 F單彎造影管（Cordis），泰爾茂泥鰍導(dǎo)絲，顯微手術(shù)器械，動脈夾，注射器，26 G靜脈輸液針，醫(yī)用氮?dú)猓懿ＡмD(zhuǎn)子氣體流量計，灌胃針，普通采血管，Eppendorf管，載玻片。低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)，型號：TDL-80-2B），DSA血管造影機(jī)（AXIOM Artis dTA），光學(xué)顯微鏡（品牌：OLYMPUS，型號：DP73），切片機(jī)（德國MICROM公司生產(chǎn)，型號：HM 325），漂烘片機(jī)（常州市雅博電子設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號：YABO 200）。

1.3 模型制備 參考文獻(xiàn)［6］行頸動脈內(nèi)膜氣體干燥損傷法制備CAS模型，具體如下：術(shù)前禁食12 h，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥30 mg/kg麻醉家兔，于右側(cè)頸動脈搏動處脫毛（直徑約15 cm），消毒后仰臥固定于兔臺，采用無菌手術(shù)技術(shù)分離右側(cè)頸總動脈12 mm。動脈夾孤立血管長約8 mm，孤立段近端刺入26 G靜脈輸液針并于遠(yuǎn)端穿出血管后退回針頭于管腔內(nèi)。由穿刺針向被隔離的頸動脈段注入0.9%氯化鈉溶液2 ml，再接醫(yī)用氮?dú)猓?20 ml/min吹15 min。之后采用0.9%氯化鈉溶液置換出管腔內(nèi)氣體，恢復(fù)血流，壓迫止血。術(shù)后肌肉注射青霉素20萬U。

1.4 分組及給藥方法 所有家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)分層方法分為A、B、C、D、E 5組，每組8只，雌雄各4只。5組家兔飲水（純凈水）不限，自由攝食100 g/d，根據(jù)人與家兔用藥量換算表（60 kg成年人與1.5 kg家兔折算系數(shù)為2.30）計算藥物用量，每周測量體質(zhì)量并調(diào)整藥物用量。A組家兔給予普通飼料喂養(yǎng)，純凈水10 ml灌胃，1次/d；B組家兔模型制備后給予高脂飼料喂養(yǎng)，純凈水10 ml灌胃，1次/d；C組家兔模型制備后給予高脂飼料喂養(yǎng)，阿托伐他汀鈣2.5 mg?kg-1?d-1+純凈水10 ml灌胃，1次/d；D組家兔模型制備后給予高脂飼料喂養(yǎng)，大黃蟲丸 1.5 g?kg-1?d-1+ 純凈水 10 ml灌胃，1次/d；E組家兔模型制備后給予高脂飼料喂養(yǎng)，大黃蟲丸3.0 g?kg-1?d-1+純凈水 10 ml灌胃，1次 /d。5組家兔均連續(xù)灌胃8周。

1.5 數(shù)字減影血管造影（DSA） 5組家兔均于灌胃8周后行頸動脈DSA檢查，參考沈長銀等［7］造影方法，術(shù)前禁食12 h，飲水不限，于右腹股溝區(qū)脫毛備皮（直徑約8 cm），耳緣靜脈注射3%戊巴比妥30 mg/kg麻醉家兔，麻醉起效后仰臥固定于自制兔臺并移至DSA手術(shù)床。切開右側(cè)腹股溝區(qū)皮膚長約5 cm，鈍銳性結(jié)合分離、暴露右股動脈長約3 cm。股動脈切小口并置入泥鰍導(dǎo)絲，4 F單彎造影管尾接旋轉(zhuǎn)止血閥，肝素鹽水持續(xù)沖洗，在導(dǎo)絲輔助下置入主動脈弓造影并留取圖像，采用Photoshop軟件精確測量造影片頸動脈最狹窄區(qū)最小殘腔直徑（DMS）和狹窄遠(yuǎn)端正常頸總動脈直徑（DCC），狹窄率=（DCC-DMS）/DCC×100%。以狹窄率＜30%為輕度狹窄，30%～69%為中度狹窄，70%～99%為重度狹窄，100%為閉塞。

1.6 血脂指標(biāo)檢測方法 5組家兔均于灌胃8周后采集耳緣靜脈血5 ml并置于普通采血管中，室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min（離心半徑13 cm），將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中并置于-80 ℃冰箱中保存待測。采用酶比色法檢測血清TG、TC、LDL-C及HDL-C水平。

1.7 病理形態(tài)學(xué) 采用放血法處死所有家兔，各組取雙側(cè)頸動脈約1 cm，肉眼對比觀察其形態(tài)差異；留取右側(cè)頸動脈，0.9%氯化鈉溶液輕輕沖洗后吸干水分，置于10%甲醛液中固定，石蠟包埋，切成5 μm薄片，行HE染色，光鏡下觀察其病理學(xué)改變并拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；等級資料分析采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頸動脈狹窄程度 灌胃8周后，5組家兔頸動脈狹窄程度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（u=19.647，P=0.001）；其中B組家兔頸動脈狹窄程度重于A、C、E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1、圖1）。

2.2 血脂指標(biāo) 灌胃8周后，5組家兔血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組家兔血清TG、TC、LDL-C水平高于A、C、E組，血清HDL-C水平低于A、C、E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D組家兔血清TG水平低于B組，C組家兔血清TC水平低于E組，D組家兔血清HDL-C水平低于E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 5組家兔灌胃8周后頸動脈狹窄程度比較（只）Table 1 Comparison of degree of carotid stenosis in the five groups of rabbits after 8 weeks of gavage

表2 5組家兔灌胃8周后血脂指標(biāo)比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups of rabbits after 8 weeks of gavage

表2 5組家兔灌胃8周后血脂指標(biāo)比較（±s，mmol/L）Table 2 Comparison of blood lipid parameters in the five groups of rabbits after 8 weeks of gavage

注：TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與E組比較，cP＜0.05

組別 只數(shù) TG TC LDL-C HDL-C A組 8 1.226±0.307 3.018±0.215 0.486±0.242 1.984±0.150 B 組 8 3.098±0.485a 5.520±0.554a 2.533±0.753a 1.090±0.269a C 組 8 1.703±0.192b 4.005±0.736bc 1.362±0.397b 1.635±0.339b D組 8 2.356±0.202b 5.047±0.752 1.915±0.319 1.371±0.237c E 組 8 1.777±0.174b 4.792±0.512b 1.623±0.429b 1.658±0.200b F值 22.389 42.588 21.165 13.820 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 病理形態(tài)學(xué)

2.3.1 肉眼觀察 A組家兔右側(cè)頸動脈色淡紅，柔軟有彈性，光澤度良好，管腔內(nèi)膜光滑；B組家兔右側(cè)頸動脈顏色蒼白，明顯缺乏彈性，管壁僵硬、增厚，管腔變窄，其內(nèi)可見淡黃色物質(zhì)附著，不光滑；C、D、E組家兔右側(cè)頸動脈顏色較B組色偏淡紅，觸之彈性尚可，其中D組家兔右側(cè)頸動脈管腔內(nèi)有少量附著物，C組和E組家兔右側(cè)頸動脈管腔未見窄縮。

2.3.2 HE染色 HE染色結(jié)果顯示，A組家兔動脈管腔無狹窄，管壁各層結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)膜光滑無明顯增生，厚薄均勻，形狀規(guī)則未見異常，中膜彈力纖維正常，平滑肌細(xì)胞（SMC）排列整齊、規(guī)則且無增殖遷移，外膜無炎性細(xì)胞浸潤；B組家兔動脈管腔變小，表面凹凸不平，內(nèi)膜薄厚不一，可見向腔內(nèi)凸起的脂質(zhì)斑塊，內(nèi)膜和中膜均出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，中膜明顯增厚，SMC增殖明顯，排列明顯紊亂，外膜可見炎性細(xì)胞浸潤；A組和C組家兔光鏡下動脈形態(tài)較為接近；D組和E組家兔動脈內(nèi)膜均較A組增厚，厚薄不一，中膜SMC增殖，但較B組薄，外膜可見少量炎性細(xì)胞浸潤；D組家兔相較于E組家兔動脈內(nèi)膜偏厚，尚有輕微隆起，內(nèi)皮下間隙增寬，可見遷移的SMC（見圖2）。

3 討論

CAS是急性腦梗死的重要發(fā)病原因之一，其可引起頸動脈管腔狹窄、腦血供減少，當(dāng)狹窄持續(xù)加重或斑塊脫落堵塞腦動脈時可造成腦血供急性阻斷、神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧性損傷［8-9］。目前，CAS的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，大量基礎(chǔ)和臨床研究表明，CAS的危險因素包括高脂血癥、高血壓、高血糖（糖尿?。?、肥胖、吸煙［10］、自體生物活性物質(zhì)（如5-羥色胺、一氧化氮、內(nèi)皮素1等）代謝紊亂［11］、慢性應(yīng)激［12］等，而解釋CAS發(fā)病機(jī)制的學(xué)說包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說（脂源性學(xué)說）、血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）克隆學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說［13］、血栓形成學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說、炎癥學(xué)說等。近年來隨著人們對CAS發(fā)病機(jī)制的研究深入，發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)參與CAS的發(fā)生發(fā)展過程［14］。

圖1 頸動脈DSA檢查結(jié)果Figure 1 DSA examination results of carotid artery

圖2 5組家兔右側(cè)頸動脈光鏡下病理學(xué)表現(xiàn)（HE染色，×10）Figure 2 Pathological manifestation of right carotid artery in the five groups of rabbits under light microscope

他汀類藥物是臨床廣泛使用的調(diào)脂穩(wěn)斑、逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化的有效藥物，阿托伐他汀鈣是其代表藥物，能有效降低血脂、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，甚至促進(jìn)斑塊消退，抑制炎性反應(yīng)［15］。近年來中醫(yī)藥成為防治CAS的研究方向，其中活血化瘀藥物是研究熱點(diǎn)。劉梨等［16］研究表明，中醫(yī)藥可通過軟堅散結(jié)作用而穩(wěn)定斑塊，促使斑塊面積縮小甚至消退。賈運(yùn)喬等［17］研究表明，活血化瘀藥物大黃蟲丸的調(diào)脂作用（降低LDL-C水平、升高HDL-C水平）是其抗AS機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，B組家兔頸動脈狹窄程度重于A、C、E組，提示大劑量大黃蟲丸能有效減輕CAS家兔頸動脈狹窄程度，與阿托伐他汀鈣治療效果相似。本研究結(jié)果還顯示，B組家兔血清TG、TC、LDL-C水平高于A、C、E組，血清HDL-C水平低于A、C、E組；D組家兔血清TG水平低于B組，C組家兔血清TC水平低于E組，D組家兔血清HDL-C水平低于E組，提示大劑量大黃蟲丸能有效改善CAS家兔血脂代謝，但較阿托伐他汀鈣治療效果略差。