丹參酮ⅡA通過調(diào)控巨噬細胞極化抗動脈粥樣硬化的機制研究

陳 萍 陳文娜

1.遼寧中醫(yī)藥大學研究生學院 (遼寧 沈陽 110032);2.遼寧中醫(yī)藥大學醫(yī)學檢驗學院(遼寧 沈陽 110032)

動脈粥樣硬化是心腦腎等多種血管相關(guān)性疾病的主要病理基礎(chǔ)，近年來，隨著人類生活方式的改變和生活水平的改善，其發(fā)病逐漸呈現(xiàn)年輕化，發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為研究的熱點問題之一[1]。目前研究認為，動脈粥樣硬化的發(fā)病主要是由于長期的高脂飲食，加之運動減少，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，低密度脂蛋白、膽固醇等異常沉積于血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，血管內(nèi)斑塊形成，管壁增厚，彈性降低而發(fā)展成為動脈粥樣硬化[2]。現(xiàn)代研究認為，血管內(nèi)皮沉積導(dǎo)致的炎癥損傷在動脈粥樣硬化進程中發(fā)揮著重要作用，而巨噬細胞為體內(nèi)重要的免疫細胞，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，巨噬細胞主要存在兩種亞型，即經(jīng)典激活的M1型巨噬細胞和替代性激活的M2型巨噬細胞，研究表明，不穩(wěn)定斑塊組織中主要以M1 型巨噬細胞為主，而穩(wěn)定斑塊組織中M2 型巨噬細胞比例增加，M1 與M2 型巨噬細胞處于動態(tài)平衡中[3]。因此，我們認為調(diào)控巨噬細胞適度的分化不僅可以減輕M1型巨噬細胞造成的血管損傷，同時亦可增強M2型巨噬細胞的抗炎反應(yīng)，有助于血管的修復(fù)。丹參酮ⅡA是活血祛瘀中藥丹參的主要有效成分，具有抗氧化、抗凋亡等藥理學作用，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[4-5]。本研究從巨噬細胞極化為切入點，深入探討丹參酮ⅡA抗動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級ApoE-/-小鼠20只，相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠10只，8周齡，購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于我校SPF級動物中心。

1.2主要試劑與儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉購于上海第一生化藥業(yè)有限公司(國藥準字H31022558，生產(chǎn)批號1411105)，TG、TC、LDL、HDL檢測試劑盒購于四川邁克生物科技有限公司。

1.3動物分組、造模及干預(yù) 20只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組和丹參酮ⅡA干預(yù)組(簡稱“干預(yù)組”)，均給予高脂飼料喂養(yǎng)，復(fù)制動脈粥樣硬化模型；10只C57BL/6J作為對照組，予普通小鼠維持飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后，干預(yù)組予腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉，10 mg·kg-1·d-1，模型組和空白組給予等量生理鹽水腹腔注射。12周后，0.5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，心臟穿刺收集血液并分離血清，分離小鼠腹主動脈至主動脈，分別固定于4%多聚甲醛和凍存于-80 ℃超低溫冰箱中待測。

1.4檢測指標及方法

1.4.1 血脂水平檢測 采用全自動生化分析儀分析各種小鼠血清血脂水平變化。

1.4.2 主動脈組織形態(tài)學檢測 分別采用HE染色法觀察各組小鼠主動脈組織形態(tài)學變化。將4%多聚甲醛溶液中固定的主動脈組織取出進行包埋切片，切片厚度為5μm，烘片后進行脫蠟、復(fù)水，蘇木素-伊紅染色，最后使用中性樹膠進行封片，普通光學顯微鏡下觀察主動脈組織形態(tài)學變化，并采集圖像。

1.4.3 Western Blot法檢測相關(guān)蛋白磷酸化水平變化 采用Western Blot法檢測各組小鼠主動脈NF-κB、STAT1、STAT6蛋白水平變化。取小鼠主動脈20mg，采用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，loading Buffer與提取后的蛋白裂解液混合后，100℃金屬液加熱5分鐘。采用SDS-PAGE凝膠電泳法分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1h后，一抗孵育，4℃過夜，次日回收一抗，TBST洗膜3次，每次5～10分鐘，室溫下二抗孵育1h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5～10分鐘，洗膜后采用ECL發(fā)光液進行發(fā)光，化學法學發(fā)光儀下進行曝光并拍攝圖像。

1.4.4 RT-PCR法檢測相關(guān)mRNA水平變化 采用RT-PCR檢測各組小鼠主動脈TNF-α、IL-6、TGF-β1和IL-10 mRNA表達水平。取50mg主動脈組織液氮低溫研磨后加入1 mL Trizol，加入氯仿μL，離心后，取上層水相，加入等量異丙醇沉淀RNA，離心，加入75%乙醇洗滌，離心，風干后加入無RNA 酶水溶解。紫外吸收測定法測定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板，采用SYBR Green 進行實時熒光PCR，反應(yīng)參數(shù)為95℃ 30s，1個循環(huán);95℃ 5s，55℃10 s，40個循環(huán)反應(yīng)，采用△△Ct法計算各組表達差異。全部引物有大連Taraka生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列表

注：F,forward;R,reverse

2 結(jié)果

2.1各組小鼠血脂水平變化情況 血脂水平檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠血清TG、TC和LDL水平明顯升高(P<0.01 或P<0.05)，血清HDL水平降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與模型組比較，丹參酮干預(yù)組小鼠血清TG、TC、LDL水平降低(P<0.01或P<0.05)。

圖1 注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2各組小鼠主動脈組織形態(tài)學變化 HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠主動脈內(nèi)有明顯斑塊形成；與模型組比較，丹參酮ⅡA干預(yù)組主動脈內(nèi)斑塊明顯減小。

圖2

2.3各組小鼠主動脈蛋白水平變化 Western Blot結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠主動脈與M1極化相關(guān)的信號通路NF-κB、STAT1磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，與M2極化相關(guān)的信號通路STAT6磷酸化水平降低(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組小鼠主動脈NF-κB、STAT1磷酸化水平降低(P<0.05)，STAT6磷酸化水平明顯升高(P<0.05),見圖3。

圖3 各組小鼠主動脈蛋白表達情況 注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4各組小鼠主動脈mRNA水平變化 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠主動脈與M1型細胞活化相關(guān)的基因(促炎因子)TNF-α、IL-6 mRNA水平升高(P<0.05)，而與M2型細胞活化相關(guān)的基因(抗炎因子)TGF-β、IL-10 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組小鼠主動脈TNF-α、IL-6 mRNA水平降低(P<0.05)，TGF-β、IL-10 mRNA水平升高(P<0.05),見圖4。

圖4 各組小鼠主動脈基因mRNA表達情況 注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥引發(fā)的疾病，最終導(dǎo)致動脈壁增厚及斑塊形成，是誘發(fā)心肌梗塞及中風等心血管疾病的主要因素。目前研究認為動脈粥樣硬化的發(fā)生為一個慢性的炎癥反應(yīng)過程，主要為脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)膜，導(dǎo)致單核細胞募集并被刺激分化為巨噬細胞吞噬脂滴形成泡沫細胞逐漸發(fā)展成為動脈粥樣硬化斑塊[6-7]。巨噬細胞的分型是根據(jù)其極化后所發(fā)揮的功能進行命名的，即以分泌促炎因子為主、發(fā)揮促炎活性的為M1型巨噬細胞；分泌抗炎因子、發(fā)揮抗炎及組織修復(fù)作用的細胞為M2型巨噬細胞[8-9].既往研究發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊組織中主要以M1 型巨噬細胞為主，而穩(wěn)定斑塊組織中M2 型巨噬細胞比例增加，M1 與M2 型巨噬細胞處于動態(tài)平衡[10]。M1型巨噬細胞可以產(chǎn)生大量一氧化氮(NO)、活性氧等中間產(chǎn)物，在血管內(nèi)皮損傷過程中發(fā)揮著重要作用，而M2型巨噬細胞可產(chǎn)生大量IL-10及少量IL-12，參與組織重塑、血管發(fā)生和腫瘤發(fā)展等過程，同時有研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞的活化能有效減輕M1 型巨噬細胞引發(fā)的血管免疫損傷，對于炎癥反應(yīng)后期的組織損傷具有修復(fù)和重塑作用[11-12]。

中醫(yī)學認為，動脈粥樣硬化為本虛標實之證，氣虛血虧，脾虛痰濕不化，內(nèi)生痰濁、血瘀，加之感受外邪、飲食失調(diào)、情志不暢等因素為誘因?qū)е卤静〉陌l(fā)生，認為心主血脈功能失司，血脈失于濡養(yǎng)，氣血運行不暢，加之肥甘厚味，脾虛痰濁內(nèi)生，瘀血阻滯，痰瘀互結(jié)，而導(dǎo)致本病發(fā)生的主要病機[13-14]。中醫(yī)學對于本病的治療多采用活血化瘀法進行干預(yù)[15]，中藥丹參是治療心血管疾病常用的中藥，臨床療效確切，課題組既往研究發(fā)現(xiàn)中藥丹參的有效成分丹參酮II A能夠有效改善動脈粥樣硬化硬化小鼠血脂水平及主動脈斑塊形成情況，但其具體機制尚不明確，本次研究以巨噬細胞極化在動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及炎癥反應(yīng)為切入點，深入探討丹參酮II A抗動脈粥樣硬化的機制。本研究結(jié)果顯示，與對照比較，模型組小鼠血清TG、TC和LDL水平明顯升高，主動脈內(nèi)有明顯斑塊形成，巨噬細胞分泌的促炎因子水平明顯升高，而經(jīng)丹參酮II A干預(yù)后，與模型組比較，干預(yù)組小鼠血清TG、TC、LDL水平明顯降低，主動脈內(nèi)斑塊明顯減小，巨噬細胞分泌的促炎因子水平明顯減低，抗炎因子水平明顯升高。研究結(jié)果表明，丹參酮ⅡA可有效誘導(dǎo)動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞從M1型向M2型極化的過渡，降低斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而延緩動脈粥樣硬化斑塊的進展。同時，我們發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)p-STAT1/NF-κB信號通路可誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化，而丹參酮ⅡA可有效激活p-STAT6磷酸化，誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化，從而降低炎癥反應(yīng)，提高動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。