基于分子對(duì)接方法研究山核桃葉黃酮單體對(duì)痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎中NLRP3炎癥信號(hào)通路的作用

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

痛風(fēng)是由體內(nèi)嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸生成增多和（或）尿酸排泄減少所引起的一種慢性低毒性炎癥反應(yīng)性疾病，特征為尿酸鹽沉積，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫、疼痛，并發(fā)痛風(fēng)石沉積、關(guān)節(jié)畸形、腎功能不全等癥狀，嚴(yán)重危害人們健康。研究表明，沉積的尿酸鹽結(jié)晶被固有免疫識(shí)別受體結(jié)合后能夠啟動(dòng)寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide-binding oligomerization domain leucine rich repeat and pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥信號(hào)通路，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[1]。臨床治療藥物如秋水仙堿，可作用于NLRP3炎癥信號(hào)通路治療痛風(fēng)，但存在較大的不良反應(yīng)[2]，因此新藥物的開(kāi)發(fā)仍是痛風(fēng)研究的熱點(diǎn)。某些抗炎中藥能夠有效防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，而且成分天然、不良反應(yīng)少，引起了研究者的廣泛關(guān)注[3]。

既往研究證實(shí)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、NLRP3、天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶-1 （cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量增加[4]。邢志華等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物葛根素可防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮總黃酮可通過(guò)抑制NLRP3炎癥信號(hào)表達(dá)，降低炎癥效應(yīng)[6]。以上實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，與含黃酮類(lèi)成分的中藥具有清熱祛濕、化瘀通絡(luò)的功效相呼應(yīng)，因此，筆者推測(cè)含有黃酮成分的中藥可能是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的潛在新藥[7]。中藥的抗炎作用具有多靶多效的特點(diǎn)，但是其組成成分復(fù)雜，靶標(biāo)關(guān)聯(lián)不明確，導(dǎo)致在分子水平研究中藥抗炎機(jī)制的報(bào)道較少。而以計(jì)算機(jī)軟件為基礎(chǔ)的分子對(duì)接技術(shù)可立足于中藥已知成分，將中藥成分和炎癥蛋白進(jìn)行模擬對(duì)接，推測(cè)藥物作用機(jī)制，該項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于中藥抗炎活性成分的篩選和作用靶標(biāo)的確定[8]。本文利用分子對(duì)接技術(shù)，以山核桃葉總黃酮中的5種主要單體漢黃芩素、白楊素、小豆蔻明、球松素查爾酮、松屬素[9]為配體，與NLRP3炎癥通路信號(hào)蛋白進(jìn)行半柔性對(duì)接，研究山核桃葉黃酮單體對(duì)NLRP3炎性體及其通路信號(hào)的作用靶點(diǎn)，明確山核桃葉黃酮單體抗痛風(fēng)藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供藥物治療的新方向。

1 材料和方法

1.1 黃酮配體收集與建立 利用軟件ChemBioDraw構(gòu)建山核桃葉總黃酮中各單體的平面結(jié)構(gòu)：小豆蔻明（cardamonin）、白楊素（chrysin）、松屬素（pinocembrin）、球松素查爾酮（pinostrobin Chalcone）、漢黃芩素（wogonin），結(jié)構(gòu)式如圖1所示。將其保存為CDX文件，導(dǎo)入軟件ChemBio3D中呈現(xiàn)其三維立體結(jié)構(gòu)，利用分子力場(chǎng)MM2簡(jiǎn)單優(yōu)化后設(shè)置動(dòng)力學(xué)模擬參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化后的分子進(jìn)行類(lèi)藥性質(zhì)分析。

圖1 5種黃酮單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of five flavonoids monomers

1.2 蛋白受體收集與建立 查閱文獻(xiàn)，收集與NLRP3通路相關(guān)的報(bào)道，了解到NLRP3信號(hào)傳遞不僅和NLRP3炎性體有關(guān)，還與鉀鈣離子濃度、細(xì)胞表面嘌呤受體P2X配體門(mén)控的離子通道7（purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7，P2X7）、乙?；⒐艿鞍?、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、花生四烯酸代謝等路徑存在聯(lián)系，最終確定了22個(gè)與NLRP3信號(hào)通路相關(guān)的蛋白，從RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/pdb）中篩選對(duì)應(yīng)的人源受體靶點(diǎn)蛋白[10]。見(jiàn)表1。

1.3 分子對(duì)接流程 利用軟件Discovery Studio 2.5預(yù)處理靶蛋白，處理完畢后以PDB格式存儲(chǔ)，得到半柔性蛋白。用軟件Auto Dock進(jìn)行分子對(duì)接，先后導(dǎo)入經(jīng)ChemBio3D處理的山核桃葉黃酮單體以及經(jīng)Discovery Studio 2.5預(yù)處理的靶點(diǎn)蛋白。

1.3.1 參數(shù)文件準(zhǔn)備 使用AutoGrid 4.0進(jìn)行能量格點(diǎn)計(jì)算，將靶點(diǎn)蛋白（macromolecule）設(shè)置為中心坐標(biāo)（center），使Gird Box網(wǎng)格區(qū)域覆蓋所研究的靶點(diǎn)蛋白。使用AutoDock 4.0搜索網(wǎng)格范圍內(nèi)對(duì)接區(qū)域，采用拉馬克遺傳算法（Lamarckian GA 4.2）進(jìn)行區(qū)域搜索，初始種群數(shù)設(shè)置為150，能量評(píng)定最大次數(shù)為2 500 000，每個(gè)小分子配體都設(shè)定得到20個(gè)構(gòu)象，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。

表1 人源受體靶點(diǎn)蛋白信息Tab.1 Information of human receptor target proteins

1.3.2 分子對(duì)接計(jì)算 采用AutoGrid 4.0計(jì)算格點(diǎn)中相關(guān)能量，運(yùn)行AutoDock 4.0進(jìn)行區(qū)域搜索，進(jìn)行半柔性對(duì)接，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析。因篇幅限制，以結(jié)合能（binding energy，BE）作為輔助判斷，篩選出抑制常數(shù)（inhib constant，IC）小于10的靶點(diǎn)蛋白，并將最佳構(gòu)象導(dǎo)入軟件PyMOL，呈現(xiàn)復(fù)合物構(gòu)象，分析觀察山核桃葉黃酮單體與NLRP3炎癥信號(hào)蛋白的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 山核桃葉黃酮單體的類(lèi)藥性質(zhì) 經(jīng)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化后，山核桃葉黃酮單體小豆蔻明、白楊素、松屬素、球松素查爾酮和漢黃芩素的類(lèi)藥五性質(zhì)（相對(duì)分子質(zhì)量、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)、氫鍵受體數(shù)目、氫鍵給體數(shù)目和脂水分配系數(shù)）數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.2 靶點(diǎn)蛋白篩選 半柔性對(duì)接后，篩選出IC小于10的靶點(diǎn)蛋白，靶點(diǎn)蛋白與山核桃葉黃酮單體小豆蔻明、白楊素、松屬素、球松素查爾酮和漢黃芩素相互作用的BE、IC、氫鍵組成原子及其鍵長(zhǎng)和鍵角等相關(guān)信息見(jiàn)表3。

2.3 靶標(biāo)分析 對(duì)接結(jié)果顯示，N-乙?；D(zhuǎn)移酶與多種黃酮單體對(duì)接較好，可能為黃酮單體治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的共同作用位點(diǎn)，進(jìn)一步將N-乙?；D(zhuǎn)移酶與多種黃酮單體進(jìn)行對(duì)接的終末文件導(dǎo)入PyMOL軟 件，分析對(duì)接結(jié)果的三維結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖2。

表2 山核桃葉黃酮單體的類(lèi)藥性質(zhì)Tab.2 Drug-like properties of flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

表3-1 靶點(diǎn)蛋白與山核桃葉黃酮單體對(duì)接結(jié)果及相互作用Tab.3-1 Docking interactions between target protein and flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

表3-2 靶點(diǎn)蛋白與山核桃葉黃酮單體對(duì)接結(jié)果及相互作用Tab.3-2 Docking interactions between target protein and flavonoids monomers from Carya cathayensis leaves

圖2 黃酮單體與N-乙?；D(zhuǎn)移酶作用Fig.2 Interaction between flavonoids monomers and N-acetyltransferase

3 討論

大量研究表明，關(guān)節(jié)腔中析出的尿酸鹽結(jié)晶可刺激NLRP3中C端的LRR，使N端PYD募集ASC和caspase-1，形成NLRP3炎性體，寡聚化后活化caspase-1，酶解IL-1β前體，釋放成熟的IL-1β，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11-12]。正常情況下，NLRP3被HSP90、SGT1抑制，處于靜止?fàn)顟B(tài)，而尿酸鹽沉積后不僅可通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH） 氧化酶，使TXNIP脫離TRX，氧化線粒體DNA，以此激活NLRP3炎性體，還能在乙?；⒐艿鞍椎膮⑴c下，刺激單核-巨噬細(xì)胞表達(dá)NLRP3炎性體。有研究表明，細(xì)胞膜表面的P2X7可通過(guò)影響細(xì)胞鉀離子平衡，激活NLRP3炎性體[13-14]。

依據(jù)對(duì)接結(jié)果，本研究提示，山核桃葉黃酮單體可作用于NLRP3炎癥通路的多個(gè)靶點(diǎn)，且抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制存在差異。按IC排序，依次是小豆蔻明、球松素查爾酮、漢黃芩素、白楊素和松屬素。小豆蔻明阻斷NLRP3炎性體激活及其信號(hào)傳遞可能與抑制N-乙?；D(zhuǎn)移酶-2、TXNIP和caspase-1的活性，以及抑制核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的釋放，抑制NLRP3炎性體（LRR）激活、影響花生四烯酸代謝等有關(guān)。球松素查爾酮的生物活性可能主要是抑制花生四烯酸代謝，抑制HSP和TRX2的活性，以及抑制pro-caspase-1酶解，同時(shí)可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞鉀離子濃度失控。漢黃芩素可能阻斷NLRP3炎性體（PYD）活化，抑制N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶-1活性以及caspase-1前體的酶解，以及阻斷IL-1R與配體的結(jié)合。白楊素主要抑制N-乙?；D(zhuǎn)移酶-2、N-乙?；D(zhuǎn)移酶-1、caspase-1和HSP的活性，以及阻斷NLRP3炎性體（PYD）的活化。松屬素可能抑制NLRP3炎性體（LRR）激活，抑制N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶-2、N-乙?；D(zhuǎn)移酶-1、TRX2和TXNIP的活性，以及抑制IL-1R與配體結(jié)合。

據(jù)研究報(bào)道，黃酮類(lèi)中藥提取物可降低由尿酸鹽沉積引起的痛風(fēng)小鼠關(guān)節(jié)腫脹度，并減少滑膜組織NLRP3、ASC、caspase-1等蛋白表達(dá)，提示黃酮類(lèi)中藥可抑制NLRP3炎性體軸表達(dá)[15-16]，此與本實(shí)驗(yàn)分子對(duì)接的結(jié)果一致。在糖尿病治療研究中，黃酮類(lèi)藥物還可提高鈉-鉀-ATP酶活性，向細(xì)胞內(nèi)泵入鉀離子，由此調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子濃度[17]，從而緩解由尿酸鹽引起的細(xì)胞鉀離子流失，抑制NLRP3炎性體的激活。N-乙?；D(zhuǎn)移酶參與微管蛋白對(duì)NLRP3的排列和激活，且有報(bào)道證實(shí)其與藥物性肝傷害及炎癥密切相關(guān)[18]，本實(shí)驗(yàn)分子對(duì)接結(jié)果顯示，其與多種黃酮單體對(duì)接較好，提示黃酮通過(guò)活性基團(tuán)羥基和羰基抑制微管蛋白乙?；?，從而阻止其對(duì)NLRP3的激活，并緩解藥物性肝損傷及炎癥反應(yīng)，與現(xiàn)有報(bào)道天然黃酮可治療化學(xué)性肝損傷并能抑制炎癥反應(yīng)一致[19]。

NLRP3炎性體與心血管疾病密不可分，有學(xué)者在研究中藥黃酮類(lèi)提取物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥物中的各黃酮單體之間可能存在協(xié)同作用，以此增加抗炎效果[20-21]。也有研究發(fā)現(xiàn)山核桃葉黃酮單體能夠作用于Toll/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88） 通路，抑制NF-κB釋放，減少炎癥因子的表達(dá)從而可以防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[22]。此外，黃酮類(lèi)藥物在治療缺血再灌注損傷時(shí)可抑制一氧化氮合酶活性，從而起到抗氧化作用，其中羥基作為取代基發(fā)揮抗氧化活性，不僅可電離出氫原子中和氧自由基，還能抑制花生四烯酸代謝酶及其代謝產(chǎn)物的活性，從而保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[23-25]。

中藥黃酮成分天然、多靶多效，可作為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療藥物的研究方向。本研究借助分子對(duì)接技術(shù)模擬并探討了山核桃葉黃酮單體成分抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)山核桃葉提取物中5種主要黃酮單體可通過(guò)多途徑抑制NLRP3炎性體的激活和信號(hào)傳遞，且各單體均與N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合較好，可作為抗痛風(fēng)藥物研究的新方向。從中藥中篩選抗痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的活性單體，研究其作用靶點(diǎn)和機(jī)制，是目前研究天然藥物防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的熱點(diǎn)。分子對(duì)接技術(shù)可構(gòu)建藥效物質(zhì)-作用靶點(diǎn)關(guān)系，發(fā)掘中藥藥效基礎(chǔ)及其抗炎機(jī)制，為探索治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的活性成分、治療靶點(diǎn)等提供參考。但本文只在理論上預(yù)測(cè)了山核桃葉黃酮單體對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎NLRP3炎癥信號(hào)通路的作用機(jī)制，準(zhǔn)確度較低，需進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行實(shí)際驗(yàn)證，使研究結(jié)論更具科學(xué)性。