電針對(duì)糖尿病神經(jīng)痛大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

瞿思穎 邰昭霞 費(fèi)雪瑜 邵曉梅,3 何曉芬,3 方劍喬,3 蔣永亮,3

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江省針灸神經(jīng)病學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所

糖尿病具有多種并發(fā)癥，糖尿病神經(jīng)痛（diabetic neuropathic pain，DNP）就是其中一種，其發(fā)病率很高[1]，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，目前藥物治療方案有限，而且療效不佳。DNP常表現(xiàn)為痛覺(jué)敏化[2]，其中中樞敏化是DNP發(fā)生、維持的主要機(jī)制之一，主要涉及脊髓背角神經(jīng)元的超興奮性。有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在DNP的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]，已成為治療DNP的重要靶點(diǎn)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要標(biāo)志物之一為膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。也有研究表明，脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDA）受體2B亞基磷酸化（phospho-N-methyl-D-aspartic acid receptor 2B subunit，p-NR2B）與 DNP 的產(chǎn)生與維持相關(guān)[4]。

針刺是控制慢性疼痛的主要手段之一，臨床隨機(jī)對(duì)照研究證實(shí)針刺或電針（electroacupuncture，EA）可有效控制DNP[5-7]。已有研究表明，低頻EA干預(yù)DNP優(yōu)于高頻[8]，但是其具體機(jī)制有待進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立DNP大鼠模型，觀察大鼠L4～L6脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況及p-NR2B表達(dá)的變化，為應(yīng)用EA干預(yù)DNP提供重要的科學(xué)依據(jù)與理論闡釋。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠26只購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]，35 周齡，體質(zhì)量（135±15）g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184]。正常組大鼠予以嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼養(yǎng)組予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)，均自由飲水。飼養(yǎng)室溫度維持在（24±2）℃，12h燈光晝夜循環(huán)。

1.2 主要儀器與試劑 HANS 200E型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀購(gòu)于北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司；37450型動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀為意大利Ugo Basile公司產(chǎn)品；激光共聚焦顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司。兔抗大鼠GFAP多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)abcam公司（批號(hào)：GR154650-5）；兔抗大鼠p-NR2B抗體購(gòu)于美國(guó)GeneTex公司（批號(hào)：821502001）；驢抗兔 Alexa Fluor488 IgG（H+L）二抗購(gòu)于美國(guó)Jackson Immunolab公司（批號(hào)：138271）。

1.3 造模與分組 以完全隨機(jī)分組法將大鼠分為正常組（6只）與高脂高糖飼養(yǎng)組（20只）。正常組大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼養(yǎng)組大鼠予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)5周，繼以腹腔注射35mg/kg的鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），正常組給予相同劑量的檸檬酸緩沖液腹腔注射。STZ注射3d后檢測(cè)空腹血糖，血糖穩(wěn)定且≥11.1mmol·L-1的大鼠入選實(shí)驗(yàn)。2周后檢測(cè)大鼠的機(jī)械痛閾，血糖升高和痛閾下降作為DNP模型造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。高脂高糖飼養(yǎng)組大鼠中2只死亡，4只血糖未升高，2只痛閾未下降，最終造模成功的大鼠共12只。將造模成功的大鼠分為DNP模型組和EA組，每組6只。

1.4 EA干預(yù) 造模成功后開(kāi)始EA干預(yù)，采用0.25mm×13mm的毫針，選用雙側(cè)“足三里”“昆侖”穴，進(jìn)針后連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀。電針參數(shù)：頻率2Hz，強(qiáng)度1mA，干預(yù) 15min；2mA 干預(yù) 15min，共 30min，1 次/d，持續(xù)1周。

1.5 痛閾測(cè)定 采用動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀檢測(cè)大鼠機(jī)械縮足反射閾值（paw withdrawal threshold，PWT）[9]。分別于造模前、造模后5、7和8周進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)量前將大鼠置于塑料盒內(nèi)適應(yīng)環(huán)境20min，待大鼠安靜后，用金屬絲對(duì)大鼠足底給予機(jī)械刺激。刺激力量從0g開(kāi)始，以2.5g/s的速度遞增，最大刺激力量為50g，避免大鼠足底受傷。共檢測(cè)5次，每次檢測(cè)間隔5min，去掉最大值和最小值，取余下3次的平均值。

1.6 免疫熒光檢測(cè)大鼠腰段脊髓背角GFAP、p-NR2B陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá) 大鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.35mL/100g）腹腔麻醉后，以4℃的0.9%氯化鈉溶液經(jīng)左心室、升主動(dòng)脈快速灌注，再以4%多聚甲醛灌注后快速分離脊髓L4～L6節(jié)段。將脊髓置于4%多聚甲醛溶液中固定6h，經(jīng)15%和30%的蔗糖溶液梯度脫水，液氮快速冷凍后，行30μm冰凍切片。脊髓切片以TBST漂洗5min，漂洗3次后，轉(zhuǎn)入24孔板，加入10%驢血清，37℃孵育1h。分別加入以含10%驢血清的TBST稀釋的兔抗大鼠GFAP抗體（稀釋比例1：1 000）和含10%驢血清的TBST稀釋的兔抗大鼠p-NR2B抗體（稀釋比例 1：400）。4℃過(guò)夜后，TBST 漂洗切片 10min，共漂洗3次，加入含10%驢血清的TBST稀釋的Alexa Fluor488驢抗兔IgG二抗（稀釋比例1：400）進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，37℃避光孵育1h，TBST清洗3次。將脊髓切片轉(zhuǎn)移至黏附載玻片上，晾干后滴加抗熒光淬滅封片液，以蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍片。每只大鼠選用3張脊髓切片，采用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)腰段脊髓背角淺層陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率（%）=脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)雨?yáng)性像素點(diǎn)/脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)涌傁袼攸c(diǎn)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PWT比較 造模前各組大鼠PWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），造模第5周高脂高糖飼養(yǎng)后STZ注射前，各組大鼠PWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后第7周，與正常組比較，DNP模型組和EA組大鼠PWT明顯下降（P＜0.01）。造模后第8周，與正常組比較，DNP模型組大鼠PWT明顯下降（P＜0.01）；與DNP模型組比較，EA組大鼠PWT明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠PWT比較Fig.1 Comparison of PWT in each group

2.2 各組大鼠腰段脊髓背角GFAP表達(dá)比較 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)覩FAP陽(yáng)性細(xì)胞見(jiàn)圖2。與正常組比較，DNP模型組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)覩FAP陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高（P＜0.01）；與DNP模型組比較，EA組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)覩FAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖2 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)覩FAP陽(yáng)性細(xì)胞（100×，標(biāo)尺：100μm）Fig.2 GFAP positive cells in lumbar spinal cord dorsal horn laminae Ⅰ～Ⅱ in each group(100×,scale bar：100μm)

圖3 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)覩FAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率比較Fig.3 Comparison of positive ratio of GFAP in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度觀察，正常組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞呈分支狀，細(xì)胞胞體小，分支長(zhǎng)而細(xì)，處于靜息狀態(tài)；DNP模型組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，分支變短，處于激活狀態(tài)，EA組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞雖處于激活狀態(tài)，但胞體較小。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)覩FAP陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)Fig.4 Morphology of GFAP positive cell in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

2.3 各組大鼠腰段脊髓背角p-NR2B表達(dá)比較 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)觩-NR2B陽(yáng)性細(xì)胞見(jiàn)圖5。與正常組比較，DNP模型組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)觩-NR2B陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯升高（P＜0.01）；與DNP模型組比較，EA組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)觩-NR2B陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖5 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)觩-NR2B陽(yáng)性細(xì)胞（100×，標(biāo)尺：100μm）Fig.5 P-NR2B positive cells in lumbar spinal cord dorsal horn laminae Ⅰ～Ⅱ in each group(100×;scale bar：100μm)

圖6 各組大鼠腰段脊髓背角Ⅰ～Ⅱ?qū)觩-NR2B陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率比較Fig.6 Comparison of positive ratio of p-NR2B in lumbar spinal cord dorsal horn laminaeⅠ～Ⅱ in each group

3 討論

近年來(lái)，糖尿病患者數(shù)量急劇上升，糖尿病并發(fā)癥已成為糖尿病患者主要死因之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康，由此產(chǎn)生的醫(yī)療費(fèi)用也給個(gè)人和社會(huì)經(jīng)濟(jì)等帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[10]。臨床上大約50%的糖尿病患者合并DNP，而DNP是糖尿病周圍神經(jīng)病變中較為嚴(yán)重的一種[1]。

研究證實(shí)，DNP主要表現(xiàn)為痛覺(jué)敏化[11]，而中樞敏化是DNP發(fā)生、維持的關(guān)鍵機(jī)制，涉及脊髓背角神經(jīng)元的超興奮性。星形膠質(zhì)細(xì)胞是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所之一，很多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子從激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放，導(dǎo)致細(xì)胞周圍的化學(xué)環(huán)境改變，引發(fā)中樞敏化。然而，以神經(jīng)細(xì)胞為作用靶點(diǎn)的藥物療法效果常常不夠理想。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物之一。多種疼痛動(dòng)物模型中均可觀察到脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增殖反應(yīng)和其特征性標(biāo)志物GFAP的表達(dá)增加[12-13]。還有研究證實(shí)，疼痛模型中伴有星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞聚集、胞體變大、分支變多、GFAP灰度值增強(qiáng)等[14]。Liddelow等[15]發(fā)現(xiàn)，疾病狀態(tài)下靜息的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩窠?jīng)毒性的A1表型，后者可以產(chǎn)生大量的炎癥因子。注射星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑氟代檸檬酸能明顯減輕由神經(jīng)損傷和炎癥因素引起的痛覺(jué)過(guò)敏和異常性疼痛[16-17]。以上研究提示星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

NMDA受體是以谷氨酸為神經(jīng)遞質(zhì)的離子型受體，其中NR2B是NMDA受體的調(diào)節(jié)亞基，在脊髓背角呈選擇性高表達(dá)。有研究表明，鞘內(nèi)注射NMDA受體NR2B亞基特異性拮抗劑艾芬地爾治療神經(jīng)痛時(shí)，脊髓背角NR2B亞基的表達(dá)明顯降低，提示脊髓背角NR2B亞基參與神經(jīng)痛的形成[18]。NR2B亞基磷酸化會(huì)影響NMDA受體的數(shù)量及功能，從而參與中樞敏化[19]。也有研究表明，脊髓背角NR2B亞基的表達(dá)量與DNP的產(chǎn)生與維持相關(guān)[4,20]。Wang等[21]研究表明，NMDA受體的亞基NR2B的表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有著密切的關(guān)系。有報(bào)道證實(shí)，EA可通過(guò)抑制脊髓背角NR2B亞基表達(dá)，從而提高神經(jīng)病理性疼痛或炎性疼痛模型的痛閾[22-23]。也有研究表明，EA通過(guò)抑制脊髓背角GFAP活化對(duì)神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[24]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂高糖飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ誘導(dǎo)DNP大鼠模型，初步探討了EA對(duì)DNP模型大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和p-NR2B表達(dá)的影響。結(jié)果表明，EA可提高DNP大鼠PWT，免疫熒光顯示DNP模型組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯增多，并且處于高度活化狀態(tài)；EA可明顯抑制DNP模型大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并且能抑制脊髓背角p-NR2B的表達(dá)。綜上所述，EA對(duì)DNP大鼠具有鎮(zhèn)痛作用，其可能的機(jī)制是抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和p-NR2B的表達(dá)。在未來(lái)的研究中將采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)GFAP和p-NR2B的共表達(dá)，并通過(guò)GFAP和NR2B的特異性激動(dòng)劑的鞘內(nèi)注射，進(jìn)一步觀察其對(duì)針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)的影響。