Cx46低表達(dá)與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和年齡相關(guān)性白內(nèi)障的關(guān)聯(lián)分析

李思佳 王中英 陳麗娟

[摘要] 目的 探討Cx46與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和年齡相關(guān)性白內(nèi)障的相關(guān)性。 方法 建立H2O2（濃度為100 μM）介導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞（SRA01/04）凋亡模型，用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Cx46蛋白表達(dá)量。利用MTT技術(shù)分析細(xì)胞生存率。利用Hoechst33342染料固定分析細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 試驗(yàn)數(shù)據(jù)闡明H2O2（濃度為100 μM）是導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因素。Cx46低表達(dá)與H2O2介導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)[蛋白表達(dá)量：H2O2 50 μM（177.67±3.65） vs H2O2 100 μM（139.02±2.13）（P<0.05）]。Cx46過(guò)表達(dá)能抑制H2O2介導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)程[凋亡率：Cx46（24.36±3.13）% vs H2O2（43.65±7.51）%（P<0.01）]。 結(jié)論 研究數(shù)據(jù)確定凋亡的晶狀體上皮細(xì)胞中Cx46低表達(dá)與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生直接相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 縫隙連接蛋白Cx46;晶狀體上皮細(xì)胞;凋亡;年齡相關(guān)性白內(nèi)障

[中圖分類號(hào)] R779.66 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）14-0019-04

[Abstract] Objective To explore the correlation between Cx46 and lens epithelial cell apoptosis， age-related cataract. Methods The apoptosis model of lens epithelial cells（SRA01/04） mediated by H2O2（concentration of 100 μM） was established. The expression of Cx46 protein was detected by Western blotting. Cell viability was analyzed using MTT technology. Cell apoptosis was analyzed by Hoechst 33342 dye fixation. Results The experimental data demonstrated that H2O2（concentration of 100 μM） was an important inducer of apoptosis in lens epithelial cells. Low expression of Cx46 was associated with H2O2-mediated apoptosis of human lens epithelial cells[protein expression： H2O2 50 μM（177.67±3.65） vs H2O2 100 μM （139.02±2.13）]（P<0.05）. Overexpression of Cx46 inhibited H2O2-mediated apoptosis in human lens epithelial cells[apoptosis rate： Cx46 （24.36±3.13）% vs H2O2 （43.65±7.51）%]（P<0.01）. Conclusion The study data determine that low expression of Cx46 in apoptotic lens epithelial cells is directly associated with the development of age-related cataract.

[Key words] Connexin Cx46; Lens epithelial cells; Apoptosis; Age-related cataract

年齡相關(guān)性白內(nèi)障（ARC）位居全世界致盲性疾病首位。大量研究證實(shí)氧化應(yīng)激引起的晶狀體上皮細(xì)胞損傷是白內(nèi)障發(fā)生的主要機(jī)制。Cx46是表達(dá)于人眼晶狀體的一種縫隙連接蛋白，其形成的縫隙連接通道能維持晶狀體細(xì)胞內(nèi)部離子和水平衡以及晶狀體的透明度和光學(xué)特性，同時(shí)Cx46也參與調(diào)控細(xì)胞的很多生命進(jìn)程，包括生長(zhǎng)、增殖、分化、保護(hù)及細(xì)胞凋亡。本研究探討Cx46的表達(dá)情況與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)液DMEM、緩沖液PBS（美國(guó)HyClone公司），6孔板（美國(guó)CoStar公司），細(xì)胞凍存瓶、離心管（美國(guó)Corning公司），鼠抗人β-Actin單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），兔抗人HIF-1α多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）二抗、兔二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽修復(fù)液、PBS緩沖液粉末、陽(yáng)離子防脫玻片、中性樹(shù)膠（北京中衫生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)、過(guò)氧化氫處理和轉(zhuǎn)染

SRA01/04細(xì)胞（中國(guó)廣州吉尼歐生物科技有限公司）培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）和100 mg/mL鏈霉素的DMEM液，在潮濕、含5% CO2、37℃環(huán)境下孵育。細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%后進(jìn)行過(guò)氧化氫處理。

相應(yīng)的DNA質(zhì)粒依據(jù)脂質(zhì)體3000（Invitrogen）使用說(shuō)明書(shū)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建Cx46-GFP融合蛋白，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，引物序列如下：正向引物5-CCGCTCGAGATGGGCGACTGGAGCTTTCTGG-3;反向引物5-CCCAAGCTTGATGGCCAAGTCCTCCGGTCTGG-3。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到經(jīng)XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶作用后的GFP載體上。

1.4 細(xì)胞活性和MTT分析

利用MTT法分析測(cè)定細(xì)胞活性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和特殊處理后，在5 mg/mL MTT溶液中孵育4 h。移棄上清液，再溶于二甲亞砜溶液中。細(xì)胞活性可利用酶標(biāo)儀測(cè)定其492 nm波長(zhǎng)處光吸收值。

1.5 凋亡檢測(cè)

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)通過(guò)使用33342染料（Sigma公司）觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變。細(xì)胞平鋪于6孔板上培養(yǎng)，經(jīng)33342染料固定后在顯微鏡下進(jìn)行分析。隨機(jī)選取5個(gè)鏡下視野統(tǒng)計(jì)凋亡的細(xì)胞核數(shù)量。

1.6 Western blotting實(shí)驗(yàn)

經(jīng)轉(zhuǎn)染以及過(guò)氧化氫處理后，SRA01/04細(xì)胞裂解提蛋白。將總蛋白直接上樣到12% SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，經(jīng)特異性抗Cx46抗體（抗β-actin抗體作為內(nèi)參）及二抗孵育后，利用皮爾斯公司的SuperSignal West Pico試劑盒的化學(xué)發(fā)光底物法，對(duì)信號(hào)進(jìn)行可視化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Cx46低表達(dá)與H2O2介導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)

利用Western blotting試驗(yàn)分析比較Cx46在對(duì)照組SRA01/04細(xì)胞和高濃度過(guò)氧化氫條件下SRA01/04細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量。見(jiàn)圖1，在100 μM過(guò)氧化氫環(huán)境中Cx46蛋白的表達(dá)水平降低[H2O2 50 μM（177.67±3.65） vs H2O2 100 μM（139.02±2.13）（P<0.05）]，表明Cx46的低表達(dá)與過(guò)氧化氫介導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)。

2.2 Cx46蛋白在調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中起到重要作用

為進(jìn)一步闡述Cx46在過(guò)氧化氫介導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡中的作用，本研究構(gòu)建Cx46特異性表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)Western blotting試驗(yàn)確定轉(zhuǎn)染此特異性表達(dá)質(zhì)粒后Cx46蛋白表達(dá)量明顯增加[vector（133.20±4.50） vs Cx46（181.98±1.30）（P<0.05）]（圖2）。

隨后本研究進(jìn)行轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒后細(xì)胞增殖能力比較。轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒，并在H2O2環(huán)境下作用24 h后，其OD值為（0.29±0.03），與無(wú)H2O2環(huán)境下對(duì)照組（0.33±0.02）比較，對(duì)SRA01/04細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在H2O2處理下，轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒后，其OD值為（0.29±0.03），與未轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒組（0.20±0.01）比較，對(duì)SRA01/04細(xì)胞的增殖具有顯著促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。證實(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒能夠有效地恢復(fù)過(guò)氧化氫降低晶狀體上皮細(xì)胞生存能力的水平（圖3）。

最后，本研究分析Cx46過(guò)表達(dá)對(duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制情況。轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒，并在H2O2環(huán)境下作用24 h后，凋亡率為（24.36±3.13）%，與無(wú)H2O2環(huán)境下對(duì)照組（6.48±1.34）%比較，SRA01/04細(xì)胞的凋亡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在H2O2處理下，轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒后，凋亡率為（24.36±3.13）%，與未轉(zhuǎn)染Cx46表達(dá)質(zhì)粒組（43.65±7.51）%比較，對(duì)SRA01/04細(xì)胞的凋亡具有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說(shuō)明Cx46過(guò)表達(dá)抑制了過(guò)氧化氫介導(dǎo)的SRA01/04細(xì)胞凋亡（圖4）。這些結(jié)果證實(shí)Cx46下調(diào)是過(guò)氧化氫導(dǎo)致SRA01/04細(xì)胞凋亡所必須的。

3 討論

年齡相關(guān)性白內(nèi)障（ARC）位居全世界致盲性疾病首位[1]。調(diào)查顯示，如果白內(nèi)障發(fā)病時(shí)間能延緩十年，其手術(shù)量將會(huì)減少45%[2]，對(duì)整個(gè)社會(huì)而言將是上百億元的受益。這些潛在的利益驅(qū)使著人們?nèi)ヌ剿鞣鞘中g(shù)治療白內(nèi)障的方法。因而本研究要深入研究并闡明ARC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制。

大量的研究證實(shí)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷是白內(nèi)障發(fā)生的主要機(jī)制[3-5]。氧化應(yīng)激在各類晶狀體蛋白質(zhì)（包括酶類、晶狀體蛋白和其他伴侶蛋白質(zhì)）的降解、氧化、交聯(lián)和聚集等生命進(jìn)程中均扮演重要角色，同時(shí)也是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的觸發(fā)點(diǎn)，這些被認(rèn)為是白內(nèi)障發(fā)生與發(fā)展的普遍分子基礎(chǔ)[6，7]。過(guò)氧化氫產(chǎn)生的氧化自由基存在于眼球的前房?jī)?nèi)，來(lái)源于晶狀體上皮細(xì)胞的線粒體代謝進(jìn)程，是晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的根源[8]。據(jù)報(bào)道，白內(nèi)障患者的房水中表達(dá)高含量的過(guò)氧化氫，因此，對(duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的認(rèn)知可能為白內(nèi)障的診療提供新方法。以往研究報(bào)道稱一些細(xì)胞通路和基因在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)程中扮演著重要角色，例如Caspase3、bcl-2、hGSTA1和hGSTA2等基因[9-12]。但上述這些基因介導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的詳盡機(jī)制學(xué)研究尚待進(jìn)一步討論。

細(xì)胞間的縫隙連接是由縫隙連接蛋白組成的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道[13]。其主要功能是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間離子和小分子物質(zhì)的直接交換。Cx46是表達(dá)于人眼晶狀體的一種縫隙連接蛋白，其形成的縫隙連接通道能維持晶狀體細(xì)胞內(nèi)部離子和水平衡以及晶狀體的透明度和光學(xué)特性，同時(shí)Cx46也參與調(diào)控細(xì)胞的很多生命進(jìn)程，包括生長(zhǎng)、增殖、分化、保護(hù)及細(xì)胞凋亡。在晶狀體組織中Cx46的表達(dá)對(duì)于維持細(xì)胞間縫隙連接通道的傳遞起決定性的作用[14，15]，但是Cx46如何表達(dá)和其在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中起到何種作用的了解卻很少。

本研究的目的為進(jìn)一步詳盡地闡述過(guò)氧化氫介導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)高濃度的過(guò)氧化氫（100 μM）是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的有效誘導(dǎo)物，Cx46的低表達(dá)與此凋亡進(jìn)程相關(guān)（圖1），并且過(guò)表達(dá)的內(nèi)源性Cx46能夠抑制晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡（圖2和圖3）。以上數(shù)據(jù)表明Cx46是過(guò)氧化氫介導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡所必須的，將成為預(yù)防年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生的新的分子靶點(diǎn)。

研究中發(fā)現(xiàn)Cx46的低表達(dá)與過(guò)氧化氫介導(dǎo)SRA01/04細(xì)胞凋亡直接相關(guān)（圖1），編碼Cx46的GJA3基因確切的表達(dá)于晶狀體上皮細(xì)胞，這與Banerjee D等[13]的研究一致，其認(rèn)為Cx46表達(dá)于人類和兔的晶狀體上皮細(xì)胞，并且于晶狀體的功能而言是必須的。以往研究顯示Cx46只表達(dá)于晶狀體纖維細(xì)胞[16]，本研究推測(cè)，Cx46不僅主要存在于晶狀體纖維細(xì)胞，同時(shí)在上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，并且在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)程中扮演重要作用。

本研究證實(shí)了Cx46低表達(dá)與過(guò)氧化氫介導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其過(guò)表達(dá)能夠抑制其凋亡進(jìn)程，意味著Cx46在過(guò)氧化氫介導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)程中起重要作用，并與白內(nèi)障的發(fā)生直接相關(guān)。

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（收稿日期：2019-01-30）