赤紅球菌提取物的制備及其化學(xué)成分分析

程賢　陳洲琴　張祝蘭　楊煌建　嚴(yán)凌斌　王德森　連云陽

摘 要：為建立赤紅球菌提取物制備新工藝，以赤紅球菌Rhodococcus ruber FIM12為試驗(yàn)材料，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化赤紅球菌提取物制備條件，并進(jìn)一步分析其類脂化合物、總糖、氨基酸等主要成分。結(jié)果表明：赤紅球菌提取物制備收率為100 g濕細(xì)胞可制備3.97 g赤紅球菌提取物，其類脂化合物含量為17.48%，多糖含量44.1%，含有1種氨糖（細(xì)胞壁特征氨基酸）和18種氨基酸（其中包含8種人體必需氨基酸），種類較為豐富。研究結(jié)果可為深入開發(fā)利用赤紅球菌提取物可供參考。

關(guān)鍵詞：赤紅球菌；制備；多糖；氨基酸

中圖分類號(hào)：Q 936 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2023）04-0042-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.04.006

Preparation of Rhodococcus ruber Extract and Analysis of Its Chemical Composition

CHENG Xian， CHEN Zhou-qin， ZHANG Zhu-lan*， YANG Huang-jian，YAN Ling-bin， WANG De-sen， LIAN Yun-yang*

[Fujian Institute of Microbiology / Fujian Key Laboratory of New Drugs （Microbiology）Screening， Fuzhou， Fujian 350007， China]

Abstract： In order to establish a new process for the preparation of Rhodococcus ruber extract， by taking Rhodococcus ruber FIM-12 as the experimental material， the preparation conditions of Rhodococcus ruber extract were optimized by using the single factor test， and the main components such as lipoic acid， total polysaccharide and amino acids were further analyzed. The results showed that： the preparation yield of Rhodococcus ruber extract was as follows： 3.97 g Rhodococcus ruber extract could be prepared from 100 g wet cells， which contained 17.48% lipoic acids and 44.1% polysaccharides. It contained 1 kind of glucosamine （cell wall characteristic amino acid） and 18 kinds of amino acids （including 8 kinds of essential amino acids）， with relatively rich species. The research results could provide reference for the further development and utilization of Rhodococcus ruber extract.

Key words： Rhodococcus ruber； Preparation； Polysaccharide； Amino acid

目前，BCG-CWS（卡介苗細(xì)胞壁骨架）[1]、N-CWS（紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架）[2]等微生物菌體提取物已被研究表明具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，其多糖成分具有增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞繁殖的生物活性，已獲批用于臨床。未見赤紅球菌提取物研究的相關(guān)報(bào)道，但赤紅球菌與諾卡氏菌細(xì)胞壁成分類似，且生長快、易培養(yǎng)，可規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，具有很高的研究價(jià)值。探索赤紅球菌提取物制備新工藝有助于提高提取物收率和產(chǎn)品主要質(zhì)量控制指標(biāo)，篩選低毒性溶媒降低生產(chǎn)污染等[3-4]。因此開展赤紅球菌提取物的制備工藝研究具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)稀有放線菌細(xì)胞壁含有特異性的寡糖、肽聚糖、特殊氨基酸等，具有人體的免疫增強(qiáng)作用[5-6]，前期初步試驗(yàn)表明赤紅球菌菌體提取物對(duì)巨噬細(xì)胞等有調(diào)節(jié)功能，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，有巨大的發(fā)展?jié)摿7]。本項(xiàng)目以赤紅球菌Rhodococcus ruber FIM12為試驗(yàn)材料，開展赤紅球菌提取物制備工藝優(yōu)化研究，同時(shí)分析其類脂化合物、總糖、氨基酸等主要成分，為深入開發(fā)利用赤紅球菌提取物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

赤紅球菌Rhodococcus ruber FIM12，福建省微生物研究所保藏。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 葡萄糖（秦皇島驪驊淀粉股份有限公司）；酵母粉（安琪酵母股份有限公司）；蛋白胨（福建省仙游三和生物科技有限公司）；牛肉膏（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；鹽酸和氫氧化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）；D阿拉伯糖（純度>98%，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇和乙腈（HPLC，美國默克公司）；19種氨基酸和葡萄胺標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）。

1.2.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、NaCl 0.5%、瓊脂2.0%、pH7.2；種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%、酵母粉1.5%、pH 7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

1.2.3 儀器與設(shè)備 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Beckman公司，Allegra X15R）、超凈工作臺(tái)（亞泰科隆公司，1360B）、微生物培養(yǎng)箱（三洋公司，MIR253）、大型恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司，ZHWY2102）、超聲破碎儀（Sonices，VCX1600）、酶聯(lián)免疫儀（Molecular Devices公司，SpectraMax M5）、氨基酸分析儀（L8900）、低溫冰箱（日本三洋MDF382E型）；分析天平（IL京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Allegra X15R型離心機(jī)（德國BECKMAN公司）；安捷倫1290高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.3 赤紅球菌提取物的提取工藝優(yōu)化

Rhodococcus ruber FIM12接入種子培養(yǎng)基，32℃、230 r·min-1條件下培養(yǎng)42 h，按5%（V/V）接種量移種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃、230 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)120 h。通過單因素試驗(yàn)，分別考察全程破碎時(shí)間、單次超聲破碎時(shí)間、超聲波輸出功率和液料比對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響。

1.3.1 全程破碎時(shí)間對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 吸取菌懸液1 mL，在單次超聲時(shí)間為5 min 、超聲波輸出功率800 w、液料比為4∶1的條件下，考察不同破碎時(shí)間（5、10、15、20、30、40 min）對(duì)赤紅球菌菌體的破壁效果。

1.3.2 單次超聲時(shí)間對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 吸取菌懸液1 mL，在總超聲時(shí)間為30 min、超聲波輸出功率800 w、液料比為4∶1的條件下，考察不同單次超聲時(shí)間（1、2、3、4、5、6 min） 對(duì)赤紅球菌菌體的破壁效果。

1.3.3 超聲波輸出功率對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 吸取菌懸液1 mL，在總超聲時(shí)間為30 min、單次超聲時(shí)間5 min、液料比為4∶1的條件下，考察不同超聲波輸出功率（200、300、400、500、600、700、800 w） 對(duì)赤紅球菌菌體的破壁效果。

1.3.4 液料比對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 吸取菌懸液1 mL，在總超聲時(shí)間為30 min、單次超聲時(shí)間5 min、超聲波輸出功率800 w的條件下，考察不同液料比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 ） 對(duì)赤紅球菌的破壁效果。

通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，算出每毫升中Rhodococcus ruber濕細(xì)胞破碎前的數(shù)目（S0）和破碎后的數(shù)目（S1），按下式計(jì)算破碎率（Q）：

Q=（S1-S0）×100%

1.4 赤紅球菌提取物的制備

Rhodococcus ruber FIM12發(fā)酵液離心棄上清液，用純水洗滌Rhodococcus ruber FIM12濕菌體1次，將濕菌體細(xì)胞置于-80℃低溫24 h，反復(fù)凍融2次；以1∶4比例將純化水加入濕細(xì)胞中，在冰水浴條件下超聲波破碎處理，超聲功率 800 w，超聲時(shí)間5 min，間隔時(shí)間2 min，總時(shí)間30 min；以胰蛋白酶糜蛋白酶及鏈蛋白酶處理細(xì)胞壁碎片消化蛋白質(zhì)2次，以無水乙醇提取3 次，離心即得赤紅球菌提取物。制備3批。

1.5 赤紅球菌提取物的化學(xué)成分檢測

1.5.1 類脂化合物分析 精密稱取赤紅球菌提取物樣品50 mg，加入2.5% 2 mL NaOH溶液，在20 mL甲醇∶苯=1∶1（v

∶v）條件下回流水解2 h。水解液用1 mol·L-1的HCl中和后用乙醚提取3次，收集3次乙醚層進(jìn)行濃縮，濃縮液用無水乙醇進(jìn)行精制，即得到類脂化合物[6，8]。重復(fù)提取精制3批。

1.5.2 多糖含量測定 精密稱取在60℃減壓干燥1 h的阿拉伯糖對(duì)照品適量，將阿拉伯糖配成每1 mL含阿拉伯糖5、10、15、20、30、40、50 μg 的溶液，精密量取上述溶液各2 mL置具塞試管中，在冰浴冷卻條件下，分別加入2.0% 蒽酮乙酸乙酯液0.5 mL，濃硫酸4.0 mL，搖勻，于80℃水浴保溫30 min，立即用流水沖冷至室溫，以分光光度法于625 nm 波長處測定光密度（ 以純水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白對(duì)照） ，橫坐標(biāo)為阿拉伯糖濃度，縱坐標(biāo)為光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

采用分析天平準(zhǔn)確稱取0.2～0.5 mg赤紅球菌提取物樣品至具塞試管，加入4 mL蒸餾水混合均勻。然后在冰水浴中加入2%蒽酮乙酸乙酯溶液1.0 mL及濃硫酸8.0 mL搖勻冷卻，80℃水浴顯色30 min后以流水沖冷至室溫，于625 nm測定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量[9-10]。

1.5.3 氨基酸和氨糖含量測定 分別精密稱取18種氨基酸和葡糖胺標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL燒杯中，加水超聲溶解后配制成10 μmol·L-1的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取混合氨基酸氨糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻，為標(biāo)準(zhǔn)上機(jī)液。

精密稱取赤紅球菌提取物樣品50 mg加入水解管中，加入4 mL 6 mol·L-1 HCl，氮吹15 min后封管。將水解管置烘箱中110℃水解 22 h，冷卻開管將樣品轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取2 mL水解液，置氮吹儀于溫度60℃下脫至干燥。再準(zhǔn)確加入1 mL 0.02 mol·L-1 HCl，混勻后過0.22 μm過濾小柱。

混合氨基酸氨糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和樣品測定液分別以同體積進(jìn)樣氨基酸分析儀。色譜條件：色譜柱：離子交換樹脂、陽離子樹脂層析柱（200 mm×4.6 mm），顯色劑：茚三酮 ；緩沖液系統(tǒng)：pH 5.4的2

mol·L-1醋酸緩沖液 ；流速：0.2 mL·min-1；柱溫55℃，反應(yīng)室溫138℃。測定在440 nm和570 nm波長下的吸光度，以外標(biāo)法通過峰面積計(jì)算樣品液中的氨基酸和氨糖濃度[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤紅球菌提取物的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 全程破碎時(shí)間對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 由圖2可知，在單次超聲時(shí)間為5 min 、超聲波輸出功率800 w、液料比為4∶1的條件下，細(xì)胞的破碎率隨著全程破碎時(shí)間的延長而明顯增加，這說明破碎時(shí)間的延長可以增加超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破壞，有利于細(xì)胞的整體破碎。當(dāng)破碎總時(shí)長為30 min時(shí)，破碎率達(dá)到80%以上。繼續(xù)延長破壁時(shí)間至40 min，破碎率沒有明顯提高，并且時(shí)間太長容易破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因此選擇細(xì)胞破碎時(shí)間為30 min。

2.1.2 單次超聲時(shí)間對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 由圖3可知，在總超聲時(shí)間為30 min、超聲波輸出功率800 w、液料比為4∶1的條件下，單次超聲在1～5 min內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長，破碎率也隨之增加，但是在5～6 min后，破碎率隨著超聲時(shí)間的延長反而降低。這是因?yàn)槌暡ㄍㄟ^空化效應(yīng)破碎細(xì)胞的過程其實(shí)就是空化泡形成、振動(dòng)、壓縮和崩潰閉合的過程，短時(shí)多次的工作方式有利于空化泡有足夠的時(shí)間去完成膨脹和爆炸的過程，因此選擇單次破碎時(shí)間為5 min。

2.1.3 超聲波輸出功率對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 由圖4可知，在總超聲時(shí)間為30 min、單次超聲時(shí)間5 min、液料比為4∶1的條件下，細(xì)胞的破碎率隨著超聲波輸出功率的增加而明顯增加，這是因?yàn)檩敵龉β试酱笤接欣诳栈莸男纬膳c爆破，使破碎作用增強(qiáng)。儀器的最大功率為800 w，因此選擇輸出功率為800 w。

2.1.4 液料比對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響 由圖5可知，在總超聲時(shí)間為30 min、單次超聲時(shí)間5 min、超聲波輸出功率800 w的條件下，隨著液料比的增加，赤紅球菌菌體破碎率逐漸升高。當(dāng)液料比為 4∶1時(shí)，赤紅球菌菌體破碎率最高，隨后赤紅球菌菌體破碎率有所下降。因?yàn)闈舛忍偷臅r(shí)候減少了空化泡膨脹和爆破過程中與細(xì)胞接觸的機(jī)會(huì)，而濃度過高的時(shí)候溶液黏度增加，不利于空化泡的形成、膨脹和爆炸[12]。因此，適宜的液料比為 4∶1。

2.1.5 赤紅球菌提取物的制備 稱取100 g赤紅球菌濕細(xì)胞制備赤紅球菌提取物，連續(xù)5批次制備得到4.05、3.95、3.86、4.15及3.83 g的赤紅球菌提取物干粉，赤紅球菌提取物制備平均收率為3.97 g·hg-1濕赤紅球菌細(xì)胞。

2.2 赤紅球菌提取物的化學(xué)成分分析

2.2.1 類脂化合物含量 通過溶媒提取精制3批赤紅球菌提取物，其類脂化合物含量分別為887、876、859 mg·hg-1，占赤紅球菌提取物含量的17.74%、17.52%、17.18%，平均值為17.48%。而類脂化合物本身具有很強(qiáng)的生物活性[5]，赤紅球菌提取物中類脂化合物含量是產(chǎn)品質(zhì)量的主要控制指標(biāo)。

2.2.2 多糖含量 由表1可知，通過蒽酮硫酸法測定赤紅球菌提取物的多糖含量，測定結(jié)果分別為43.6%、42.8%、45.8%，平均值為44.1%。多糖含量決定赤紅球菌提取物的生物活性，是重要控制指標(biāo)。

2.2.3 氨基酸和氨糖含量測定 由表2（圖6）可知，赤紅球菌提取物含有1種氨糖（細(xì)胞壁特征氨基酸）和18種氨基酸（其中包含8種人體必需氨基酸），種類較為豐富。含量較高的幾種氨基酸分別為丙氨酸 57.26 mg·g-1、谷氨酸 52.637 mg·g-1、酪氨酸 49.665 mg·g-1、絲氨酸 42.103 mg·g-1、亮氨酸40.308 mg·g-1、蘇氨酸39.587 mg·g-1、二氨基庚二酸38.230 mg·g-1。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)赤紅球菌Rhodococcus ruber FIM12培養(yǎng)提純獲得赤紅球菌提取物，通過單因素試驗(yàn)研究了全程破碎時(shí)間、單次超聲破碎時(shí)間、超聲波輸出功率和液料比對(duì)赤紅球菌破壁效果的影響，得到了赤紅球菌最優(yōu)破壁工藝條件：全程破碎時(shí)間為30 min、單次超聲時(shí)間為5 min、超聲波輸出功率800 w、液料比為4∶1，在該條件下，赤紅球菌提取物制備效率為100 g濕細(xì)胞可制備3.97 g赤紅球菌提取物。

同時(shí)，對(duì)赤紅球菌提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，結(jié)果表明赤紅球菌提取物中類脂化合物17.48%，多糖含量44.1%，含有丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸等18種氨基酸和葡糖胺。微生物多糖，特別是糖綴化合物的糖鏈參與了多種生物學(xué)活動(dòng)，如細(xì)胞識(shí)別、粘連與融合、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)與應(yīng)答等，具有很高的生物活性[13-14]，氨基酸是人體不可或缺的重要物質(zhì)之一，不僅可以為身體提供能量還可以提高免疫力，具有很高的生物活性[15-16]。從化學(xué)成分來看，與BCG-CWS，N-CWS等菌體提取物成分相似，可望作為一種新的免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行開發(fā)。本研究建立了赤紅球菌提取物優(yōu)化制備工藝并較系統(tǒng)地研究了其主要化學(xué)成分，為赤紅球菌活性提取物的規(guī)?；a(chǎn)和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-02-25

作者簡介：程賢，女，1993年生，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事微生物藥物研究。

*通信作者：張祝蘭，女，1966年生，研究員，主要從事微生物藥物研究（E-mail：jessylan9963@sina.com）；連云陽，男，1969年生，博士，研究員，主要從事微生物新藥研究（E-mail：ylianfim@139.com）。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類項(xiàng)目（2020R10050014、2020R10050016）。