多指標評價酶解蠶蛹蛋白產(chǎn)物的抗氧化活性

牛明福，陳金帥，李桃月，李俊毅，李陽

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471003）

蠶蛹，作為我國桑蠶產(chǎn)業(yè)中大宗的副產(chǎn)物，資源十分豐富，它富含蛋白質(zhì)[1]，包含18 種氨基酸，必需氨基酸的含量占40%[2]，氨基酸占比合理均衡，具有較高的營養(yǎng)價值[3]，是衛(wèi)生部認可的優(yōu)質(zhì)的氨基酸來源[4]，但是對于干蠶蛹的利用，大多處于初加工階段，真正的價值并未被開發(fā)利用，亟待進行深加工處理[5]。

蠶蛹蛋白酶解可以產(chǎn)生大量的多肽及寡肽[6]，這些多肽及寡肽具有較強的生理活性，其生理活性主要由酶解產(chǎn)物中的多肽氨基酸殘基的組成決定[7]，這些生物活性肽有著較強的生理功能，具有提高機體免疫能力、促進脂肪代謝、降低高膽固醇、延緩衰老和清除自由基等功能[8-11]。閔建華等[12]探討多種酶對蠶蛹蛋白的酶解，得出蛋白酶對蠶蛹蛋白有較好的酶解效果，且有較好的抗氧化作用。張明春等[13]以胰蛋白酶酶解蠶蛹蛋白，超濾制備生物活性肽，能夠促進糖代謝中丙酮酸的生成。楊安樹等[14]利用木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶，復(fù)合酶解蠶蛹蛋白，其多肽得率為32%。

目前蠶蛹蛋白酶解制備多肽或氨基酸的技術(shù)主要有：堿水解、酸水解，堿水解其腥味和褐變難以克服，且會造成消旋作用，影響其生理活性[15]；酸水解對水源造成污染，對設(shè)備造成腐蝕，且會使部分氨基酸破壞甚至完全破壞[16]；而采用酶解的方法，克服了酸堿水解的缺點，相對環(huán)保、經(jīng)濟、有效等[17-18]，因此文章選用酶解的方法，以DPPH·清除率、O2-·清除率、總還原能力和金屬離子螯合力等常用體外抗氧化模型為指標，來研究酶解蠶蛹蛋白產(chǎn)物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蠶蛹：由伊川縣桑農(nóng)提供。中性、酸性、木瓜、獼猴桃、風(fēng)味、復(fù)合、堿性、菠蘿蛋白酶：合肥博美生物有限公司；DPPH：上海藍季科技發(fā)展有限公司，1.10-菲啰啉：科密歐化學(xué)試劑有限公司，鄰苯三酚：上海伊卡生物技術(shù)有限公司，無水乙醇：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，石油醚：鄭州海賽化工產(chǎn)品有限公司，鹽酸：河南聚興化工有限責(zé)任公司，磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、三氯化鐵：蘇州市峰益化工有限公司，鐵氰化鉀：重慶昆侖化工有限公司，三氯乙酸、H2O2：奧德利化工產(chǎn)品銷售有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris base）：上?；鄯f生物科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

N4 型紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；DJ-8D 型電熱恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療有限公司；K9860 型全自動凱氏定氮儀：海能儀器有限公司；DSA50 超聲波清洗機：福州德森精工有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器：上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解產(chǎn)物的制備

1.3.1.1 脫脂蠶蛹粉的制備與酶解

取一定量蠶蛹，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃干燥24 h，至水分含量低于5%，粉碎過40 目篩，用索氏抽取法（溶劑石油醚）抽提三次脫去油脂，烘干直至恒重，置于干燥瓶內(nèi)備用。

對蠶蛹蛋白酶解：分別取適量脫脂蠶蛹粉于試管中，加入一定pH 值的緩沖液，料液比為50 g/L，加酶量5 %，在最適溫度下酶解3 h，后調(diào)節(jié)pH 值為7.0，6 000 r/min 離心后取上清液，酶解條件如表1 所示。

1.3.1.2 多肽得率的測定

凱氏定氮法測出樣品中蛋白質(zhì)含量m0，以及酶解液氮含量m1，茚三酮比色法測定游離氨基酸的質(zhì)量m2，多肽得率如式 1 所示。

表1 8 種蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic conditions of 8 kinds of proteases

式中：D 為多肽得率；m1為酶解液中氮含量，g；m2為水解液中游離氨基酸含量，g；m0為樣品中蛋白質(zhì)含量，g。

1.3.2 抗氧化性研究

1.3.2.1 DPPH·清除能力的測定

DPPH·溶于有機溶劑能形成一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm 處[19]有強吸收，通過加入自由基清除劑，紫外吸收減弱，可以通過紫外分光光度計來測量其減弱程度，從而評價抗氧化劑的清除能力[20]。

測定方法依據(jù)代衍峰等[21]略作修改，取1.0mL樣品液，加 2.0mLDPPH 溶液（0.1 mmol/L），振蕩均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，6 000 r/min 離心取上清，于517 nm處測吸光度A1，取1.0mL樣品液，加入2.0mL無水乙醇測其吸光度A2，以1.0mL去離子水代替樣品作空白對照測量其吸光度A0，按公式（2）計算。

式中：C1為 DPPH·清除率；A1為樣液加 DPPH 所測的吸光度；A2為樣液加無水乙醇的吸光度；A0為去離子水加DPPH 的吸光度。

1.3.2.2 O2-·清除能力的測定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化生成有色中間產(chǎn)物及O2-·，在紫外325 nm 處其吸光度隨之而增加，加入抗氧化劑，O2-·被清除，使有色產(chǎn)物的生成被阻礙，導(dǎo)致吸光度的下降，通過紫外分光光度計測吸光度的大小，來評價樣品對O2-·的清除能力。

測定方法依據(jù)王戈莎等[22]，取0.1 mol/L，pH 8.2 Tris-HCl 緩沖液 2.80 mL（其中含有 2 mmol/L EDTA），加0.10mL樣液混勻，于25 ℃水浴中保溫10 min，后加入25 ℃水浴預(yù)溫的3 mmol/L 的鄰苯三酚0.10 mL，混勻后迅速于干燥的石英比色皿中，在325 nm 下每隔0.5 min 測定一次OD 值，反應(yīng)4.5 min 結(jié)束。以0.1mol/L，pH 8.2 Tris-HCl 緩沖液為空白調(diào)零，對照組以等體積去離子水代替樣品，作吸光度隨時間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率V，按下式計算樣品對O2-·的清除率。

式中：C2為 O2-·清除率；V1為對照組鄰苯三酚自氧化速率△OD/min；V2為樣品組鄰苯三酚自氧化速率△OD/min。

1.3.2.3 總還原能力的測定

鐵氰化鉀中的Fe3+被抗氧化劑還原成Fe2+，生成的產(chǎn)物在700 nm 處有最大吸收[23]，通過紫外分光光度計測其在700 nm 處的吸光度，可以評價樣品還原能力的大小，樣品的還原力與抗氧化能力正相關(guān)。

將2.0mL樣品溶液與5.0mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 值為 6.6）混勻，加入 5.0mL質(zhì)量分數(shù)為1%鐵氰化鉀溶液，將混合物在50 ℃下保溫20 min，最后加入5.0mL體積分數(shù)為10 %的三氯乙酸（Trichloroacetic acid）溶液，混勻在 3 000 r/min 下離心10 min。取2.0mL上清液和1.0mL蒸餾水混合，加入0.5mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%氯化鐵溶液，于700 nm 下測量吸光度，吸光度越高說明樣品的還原能力越強。

1.3.2.4 金屬離子螯合力的測定

過渡金屬鐵、銅等可以引起脂肪過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致生物膜受到損害，產(chǎn)生了有毒的過氧化物[24]，通過樣品對金屬離子螯合的能力來體現(xiàn)其抗氧化機制。

取 800 μL 樣品液（20 mg/mL）置于試管中，加入10 μL 氯化亞鐵溶液（2 mmol/L）和 20 μL 菲啰啉溶液（5 mmol/L），混勻后于室溫反應(yīng) 10 min，于 562 nm 下測其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解產(chǎn)物的制備

2.1.1 蠶蛹粉的脫脂

脫脂后濾渣烘干，除去殘存溶劑，研磨后過篩，獲得精制脫脂蠶蛹粉，蛋白質(zhì)含量64.32%。對脂質(zhì)提取液減壓蒸餾，低溫脫溶分離得到油脂和溶劑，得出蠶蛹的油脂含量為29.63%。

2.1.2 多肽得率的分析

酶解蠶蛹蛋白的多肽得率結(jié)果如圖1 所示。

圖1 酶解蠶蛹蛋白的多肽得率Fig.1 Peptide yield of enzymatic hydrolyzed silkworm protein

8 種酶解蠶蛹蛋白多肽得率有較大差異，堿性蛋白酶酶解的多肽得率最高13.99%。酸性蛋白酶酶解的最低為7.37%?？赡艿脑蚴遣煌鞍酌该附庑示哂休^大差異，酶切位點也不太一致，因此酶解得到的蠶蛹蛋白多肽的分子質(zhì)量大小不同，導(dǎo)致多肽得率有所不同。堿性蛋白酶的酶解效率最高，但其產(chǎn)物的抗氧化性能還需要進一步試驗。

2.2 抗氧化性能研究

2.2.1 DPPH·清除性能研究

若蛋白酶解產(chǎn)物能清除DPPH 所形成的自由基，則能表現(xiàn)出清除能力，試驗通過DPPH·清除率的高低來研究酶解產(chǎn)物的抗氧化性能。不同酶解產(chǎn)物DPPH·清除能力的測定結(jié)果如圖2 所示。

圖2 蠶蛹蛋白酶解多肽對DPPH·清除率Fig.2 DPPH·scavenging rate of silkworm proteolytic polypeptide

由圖2 可知，獼猴桃蛋白酶酶解產(chǎn)物的清除率最高為42.34%，堿性蛋白酶清除率次之為38.91%，酸性蛋白酶清除率最低為22.32%。結(jié)合多肽得率的測定結(jié)果，可能的原因是蛋白酶具有專一性，因此不同蛋白酶對同一種蛋白作用的結(jié)果不同，導(dǎo)致不同蛋白酶酶解的蠶蛹蛋白多肽分子量及自身結(jié)構(gòu)具有差異，清除DPPH·的能力也有所區(qū)別，因此表現(xiàn)的清除能力不同。堿性蛋白酶的多肽得率為13.99%比獼猴桃蛋白酶的高，但后者DPPH·清除率卻比堿性蛋白酶的高，表明了多肽含量的高低并不能決定清除能力的強弱。

2.2.2 O2-·清除性能研究

O2-·是氧基態(tài)接受電子形成的一個氧自由基，經(jīng)過一系列反應(yīng)容易形成其他有害的氧自由基，與多種疾病有著密切聯(lián)系，因此清除其對于蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的表現(xiàn)有著重要作用。酶解產(chǎn)物的O2-·清除能力的測定結(jié)果如圖3 所示。

圖3 蠶蛹蛋白酶解多肽對O2-·清除率Fig.3 Clearance rate of silkworm chrysalis proteolytic polypeptide to O2-·

由圖3 可知，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的清除率最高為43.69%，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物最低為14.65%。結(jié)合多肽得率的測定結(jié)果，可能的原因是木瓜蛋白酶多肽得率偏低，酶解產(chǎn)生的生理活性肽較少，影響了O2-·自由基的清除能力。

2.2.3 總還原能力研究

還原力是體現(xiàn)酶解產(chǎn)物提供電子能力的重要指標，自由基通過結(jié)合酶解產(chǎn)物提供的電子變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性，酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出抗氧化作用。酶解產(chǎn)物還原能力的測定結(jié)果如圖4 所示。

圖4 蠶蛹蛋白酶解多肽的總還原能力Fig.4 The total reduction ability of silkworm proteolysis polypeptides

由圖4 可知，8 種蛋白酶酶解產(chǎn)物都具有一定的還原能力，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物其還原能力最高為1.982，酸性蛋白酶的最低為0.852，可能的原因是堿性蛋白酶等的酶解產(chǎn)物提供電子的能力優(yōu)于酸性蛋白酶酶解的，從而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定物質(zhì)失去活性，阻斷了自由基的鏈式反應(yīng)，發(fā)揮了較強的抗氧化作用。另一個可能的原因是，酸性蛋白酶反應(yīng)緩沖液的pH值低，對酶解產(chǎn)物的活性有所改變，影響了其還原能力。

2.2.4 金屬離子螯合力研究

亞鐵離子會加速脂質(zhì)的氧化過程，因此可以通過測定酶解產(chǎn)物對金屬離子的螯合力來評價其抗氧化性。金屬離子螯合力的測定結(jié)果見圖5。

圖5 蠶蛹蛋白酶解多肽金屬離子螯合能力Fig.5 Chelating ability of silkworm protease polypeptide to metal ions

由圖5 可以得出，8 種蛋白酶酶解產(chǎn)物都具有一定的金屬螯合能力，蛋白酶酶解產(chǎn)物其螯合力最高為0.624，風(fēng)味蛋白酶的最低為0.221，可能的原因是堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物中含有較多的氨基羧酸類或是羥基羧酸類物質(zhì)，而這類物質(zhì)有較強的金屬螯合力，因此螯合金屬離子的能力較強，風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物中的含有的這類物質(zhì)較少，其螯合力較弱。

2.2.5 綜合抗氧化性能分析

試驗利用8 種蛋白酶分別對蠶蛹蛋白進行酶解，測定了酶解產(chǎn)物對DPPH·、O2-·的清除能力，比較了總還原能力和金屬離子螯合力的大小，較全面的評價了繅絲后脫脂蠶蛹蛋白多肽的抗氧化活性，結(jié)果表明：在加酶量一定的前提下，獼猴桃蛋白酶酶解產(chǎn)物對DPPH·清除率最高為42.34%，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物對O2-·清除率最好43.69%，總還原能力堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物最高為1.982，金屬離子螯合力堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物最佳為0.624。試驗結(jié)果還揭示了酶解產(chǎn)物多肽得率的高低與其抗氧化能力并沒有正相關(guān)性，這可能與各種酶的酶切位點不同相關(guān)，導(dǎo)致生成多肽的大小和含量有差異，酶解多肽氨基酸的結(jié)構(gòu)和組成也不盡相同，致使其抗氧化活性能力差異較大，為下一步多肽的具體分析奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

以繅絲后的蠶蛹蛋白粉為原料，分別選用中性蛋白酶等進行水解，以DPPH·清除率、O2-·清除率、總還原能力、金屬離子螯合力等作為檢測抗氧化活性的指標，較全面的評價了酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。發(fā)現(xiàn)了堿性蛋白酶酶解得到的產(chǎn)物表現(xiàn)出了較好的綜合抗氧化的能力，DPPH·清除率為38.91%，O2-·清除率為43.69%；總還原能力為1.982，金屬離子螯合力為0.624。

據(jù)文獻報道蠶蛹酶解產(chǎn)物多肽有著明顯的自由基清除能力及抗氧化性。包立軍等[25]以DPPH·清除率為指標，研究了天然家蠶及蠶絲酶解的多肽活性，實驗得出DPPH·清除率平均為62.26%；左振宇等[26]選用堿性和中性蛋白酶作為最適水解酶，在最適條件下酶解得出多肽得率33.29%，O2-·清除率為40.57%，但是其采用超聲處理的方法可能會對產(chǎn)物多肽的活性造成一定的影響，賈俊強等[27]采用堿性蛋白酶酶解蠶蛹蛋白，制備了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽（Angiotensin converting），并得出了酶解產(chǎn)物對ACE 的抑制率達96.67%；劉曼麗[28]采用體外消化模型對蠶蛹蛋白進行了處理，制備了消化多肽，并對其抗氧化活性和抗腫瘤活性進行了研究；王偉等[29]研究表明混合蛋白酶水解得到的蠶蛹多肽具有良好的抗氧化活性。本文選用8 種蛋白酶，對繅絲后脫脂蠶蛹粉進行酶解，采用4 種抗氧化能力檢測體系較全面分析了酶解產(chǎn)物的綜合抗氧化性，為進一步深入研究蠶蛹酶解多肽的生理活性奠定了基礎(chǔ)。作為抗氧化產(chǎn)品，酶解蠶蛹活性肽可以作為補充膳食的功能食品和化妝品添加劑，將體現(xiàn)出越來越高的價值。大力發(fā)展蠶蛹活性肽的研發(fā)和生產(chǎn)可以推動當?shù)匦Q絲產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型和振興，促進當?shù)亟?jīng)濟快速發(fā)展。