冬蟲夏草對氧化損傷小鼠抗氧化作用研究

羅勝勇，栗原博，樂智勇，于留榮，曹暉

（1.暨南大學藥學院，廣東廣州510632；2.安徽省醫(yī)學科學研究院，安徽合肥230061；3.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東揭陽522000；4.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東廣州510515；5.暨南大學嶺南中藥研究中心，廣東廣州510632）

生物體在新陳代謝過程中，會不斷產(chǎn)生各種活性氧自由基。正常生理情況下，適量的氧自由基對維持機體的健康具有重要作用[1]，但當自由基生成過多時，則會出現(xiàn)氧化損傷[2]，使得機體蛋白質、DNA 和脂類物質被破壞，正常細胞信號傳導被干擾，進而導致諸如心腦血管疾病、炎癥、抑郁癥、腫瘤、衰老等多種疾病的發(fā)生[3-7]。因此，開發(fā)安全、有效的具有抗氧化作用的產(chǎn)品越來越受到醫(yī)藥研究者的重視。冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）為麥角菌科真菌寄生在蟲草蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus）幼蟲上的子座及幼蟲內菌核的復合體，是一種名貴的滋補性傳統(tǒng)中藥材，具有免疫調節(jié)、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤、降血糖等多種藥理作用[8-9]。關于其抗氧化能力以往研究也較多，但主要都集中在其體外抗氧化能力方面，而對于冬蟲夏草體內抗氧化作用目前還缺少報道。因此，本實驗按照我國《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（國食藥監(jiān)保化[2012]107 號附件3）中抗氧化功能評價方法，對冬蟲夏草體內抗氧能力進行全面深入研究，并初步探討其作用機制，以期能為今后更加科學合理的蟲草資源、開發(fā)抗氧化的產(chǎn)品提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

天然冬蟲夏草（批號201607）：康美（北京）藥物研究院有限公司；D-半乳糖（批號20160406）：國藥集團化學試劑有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號20170622）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（批號 20170626）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測試盒（批號 20170627），蛋白質羰基測試盒（批號2-170908），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）（批號 20170916）、總抗氧化能力（total antioxidant activity，T-AOC）測試盒（批號20170912）：南京建成生物工程研究院。RNAiso Reagent（批號 AA4608-1）、反轉錄試劑盒（批號AK5306）、Taq DNA 聚 合 酶 、Easy Dilution 稀 釋 液 ：TaKaRa公司；引物由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。

1.2 實驗動物

1.3 儀器與設備

AL104 電子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；UV-1750 紫外可見分光光度計：日本島津公司；電熱水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠；GL-16G-Ⅱ型高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠氧化損傷模型建立（D-半乳糖誘導）

取健康成年雄性ICR 小鼠（SPF 級），適應性飼養(yǎng)后，選取體重25 g～30 g 的動物進行造模，造模動物頸背部皮下注射D-半乳糖120 mg/（kg·BW），空白組動物頸背部皮下注射等體積氯化鈉注射液，注射量均為0.1 mL/10 g，每日1 次，連續(xù)注射6 周，內眥靜脈取血測MDA，選取與空白組比較MDA 有明顯升高的動物，隨機分組[10]。

1.4.2 分組及給受試物

取造模成功動物隨機分為模型組、陽性組[維生素E，100 mg/（kg·BW）]、冬蟲夏草高[1 g/（kg·BW）]、中[0.5 g/（kg·BW）]、低[0.25 g/（kg·BW）]劑量組，每組10 只，分別灌胃給予相應受試樣品，灌胃體積為0.2 mL/（10 g·BW），另取10 只正常動物作為空白組?？瞻捉M和模型對照組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)30 d。在給受試樣品的同時，模型對照組和受試樣組頸背部皮下繼續(xù)注射120 mg/（kg·BW）D-半乳糖，正常組動物頸背部皮下注射等體積氯化鈉注射液，注射量均為0.1 mL/10 g。造模及給受試物期間，每周稱1 次體重，依據(jù)體重調整給受試物的體積。

1.4.3 血清中 MDA、蛋白羰基、GSH 含量，SOD、GSHPx、T-AOC 活性測定

給各受試樣品30 d 后，動物斷頭取血，3 000 r/min離心10 min 后，取血清，按試劑盒說明書測定血清中MDA、蛋白羰基、GSH 含量及 SOD、GSH-Px、T-AOC活性。

目前，依托南方電網(wǎng)大平臺優(yōu)化配置資源的作用，南方電網(wǎng)云南電網(wǎng)公司還將不斷擴大西電東送規(guī)模，最大限度地消納云南清潔水電。到2030年，云南省清潔能源總裝機將達到1.3億千瓦，最大電力外送能力將超過5000萬千瓦，屆時，云南將成為全國最重要的綠色能源基地和西電東送能源基地之一，電力行業(yè)將成為云南打造綠色能源牌的主力軍和排頭兵，云南清潔水電資源優(yōu)勢，也將進一步轉化成為產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢、經(jīng)濟優(yōu)勢和發(fā)展優(yōu)勢。

1.4.4 肝臟及腦組織中MDA 含量，SOD、GSH-Px 活性測定

迅速取肝臟和腦組織，稱取部分肝組織和腦組織塊，加入生理鹽水，組織勻漿器制備成10%肝組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min 后，取上清液按試劑盒說明書測定肝臟及腦組織中MDA 含量，SOD、GSH-Px 活性。

1.4.5 實時定量聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測肝組織中SOD 和 GSHPx 基因表達量

隨機取5 只動物剩余肝臟組織用無菌磷酸鹽緩沖液清洗3 次后，加液氮研磨后，加入Trizol 后提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 的濃度及純度，利用逆轉錄試劑盒合成cDNA 后，取2 μL 進行RT-PCR[11-12]檢測，逆轉錄過程及RT-PCR 過程參照說明書進行。最終結果以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，采用與熒光定量PCR 儀配套Step One Software v2.1 分析PCR數(shù)據(jù)。引物信息見表1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結果與分析

2.1 冬蟲夏草對小鼠血清中MDA含量的影響

各組小鼠血清中MDA 含量見表2。

表2 各組小鼠血清中 MDA 含量（±s，n=10）Table 2 The MDA content in serum of each group mice（±s，n=10）

表2 各組小鼠血清中 MDA 含量（±s，n=10）Table 2 The MDA content in serum of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）造模后 給受試樣品后空白 3.31±0.86 3.25±0.82模型 7.40±1.49ΔΔ 7.61±1.56ΔΔ陽性 0.1 7.38±1.63ΔΔ 5.02±1.02**冬蟲夏草高劑量 1 7.48±1.32ΔΔ 5.31±1.69**冬蟲夏草中劑量 0.5 7.36±1.27ΔΔ 5.67±1.40**冬蟲夏草低劑量 0.25 7.29±1.53ΔΔ 6.37±1.22*

通過對表2 數(shù)據(jù)進行方差分析，造模后，與空白組比較，各組MDA 含量明顯升高，表明造模成功。給受試樣品30 d 后，與模型組比較，冬蟲夏草高、中、低劑量組MDA 含量均明顯降低，差異有顯著性（p＜0.01，p＜0.05）。表明冬蟲夏草高、中、低劑量可明顯降低血清中MDA 含量。

2.2 冬蟲夏草對動物血清中蛋白質羰基、GSH含量及GSH-Px、SOD、T-AOC活性的影響

各組小鼠血清中蛋白質羰基、GSH 含量及GSHPx、SOD、T-AOC 活性見表3。

表3 各組小鼠血清中蛋白質羰基、GSH 含量及 GSH-Px、SOD、T-AOC 活性（±s，n=10）Table 3 The protein carbonyl，GSH contents and the GSH-Px，SOD，T-AOC activities in serum of each group mice（±s，n=10）

表3 各組小鼠血清中蛋白質羰基、GSH 含量及 GSH-Px、SOD、T-AOC 活性（±s，n=10）Table 3 The protein carbonyl，GSH contents and the GSH-Px，SOD，T-AOC activities in serum of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05 差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg） 蛋白質羰基/（nmol/mg）GSH/（mg/L）GSH-Px/（U/mL）SOD/（U/mL）T-AOC/（U/mL）空白 2.83±0.36 8.14±2.33 117.56±23.15 231.11±26.96 24.67±6.47模型 4.16±0.44ΔΔ 3.90±1.13ΔΔ 56.46±15.91ΔΔ 182.65±9.96ΔΔ 4.67±2.04ΔΔ陽性 0.1 3.55±0.52** 6.83±1.32** 102.33±32.67** 223.52±20.83** 20.82±5.33**冬蟲夏草高劑量 1 3.61±0.59* 5.69±1.68** 88.97±27.72** 215.63±20.62** 16.89±5.25**冬蟲夏草中劑量 0.5 3.76±0.31* 5.37±1.84* 82.35±16.68** 214.10±18.91** 15.06±5.56**冬蟲夏草低劑量 0.25 3.82±0.37 4.68±1.05 73.36±20.78* 200.32±15.23* 12.32±3.87**

通過對表3 數(shù)據(jù)進行方差分析，與空白組比較，模型組動物血清中蛋白質羰基含量明顯升高，GSH 含量，GSH-Px、SOD、T-AOC 活性明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中劑量組動物血清中蛋白質羰基含量明顯降低，GSH 含量明顯升高；高、中、低劑量動物血清中GSH-Px、SOD、T-AOC 活性明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中劑量可明顯降低血清中蛋白質羰基含量，升高GSH 含量；高、中、低劑量可明顯升高動物血清中GSH-Px、SOD、T-AOC 活性。

2.3 冬蟲夏草對動物肝臟中MDA含量，SOD、GSHPx活性的影響

各組動物肝臟組織中MDA 含量，GSH-Px、SOD活性見表4。

通過對表4 數(shù)據(jù)進行方差分析，與空白組比較，模型組動物肝臟中MDA 含量明顯升高，GSH-Px、SOD活性明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中、低劑量組動物肝臟中MDA 含量明顯降低，GSH-Px、SOD 活性明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中、低劑量均可明顯降低動物肝臟MDA 含量，升高GSHPx、SOD 活性。

表4 各組動物肝臟組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD 活性（±s，n=10）Table 4 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in liver of each group mice（±s，n=10）

表4 各組動物肝臟組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD 活性（±s，n=10）Table 4 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in liver of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05 差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）GSH-Px/（U/mL）SOD/（U/mL）空白 7.33±1.38 156.36±33.35 258.33±46.72模型 13.46±2.42ΔΔ 86.73±20.09ΔΔ 200.61±18.37ΔΔ陽性 0.1 8.62±2.37** 142.53±33.37** 243.56±33.81**冬蟲夏草高劑量 1 9.02±2.76** 136.74±30.58** 240.65±30.65**冬蟲夏草中劑量 0.5 9.88±2.57** 122.63±26.48** 238.10±28.91**冬蟲夏草低劑量 0.25 10.76±2.89* 109.56±25.46* 220.43±22.23*

2.4 冬蟲夏草對動物腦組織中MDA含量，SOD、GSH-Px活性的影響

各組動物腦組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD 活性見表5。

表5 各組動物腦組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD活性（±s，n=10）Table 5 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in brain of each group mice（±s，n=10）

表5 各組動物腦組織中 MDA 含量，GSH-Px、SOD活性（±s，n=10）Table 5 The MDA content and the GSH-Px，SOD activities in brain of each group mice（±s，n=10）

注：與空白組比較，ΔΔp＜0.01 差異極顯著；與模型組比較，*p＜0.05 差異顯著，**p＜0.01 差異極顯著。

組別劑量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）GSH-Px/（U/mL）SOD/（U/mL）空白 6.79±1.12 102.43±20.65 213.25±27.82模型 12.04±2.38ΔΔ 50.32±16.21ΔΔ 168.65±12.37ΔΔ陽性 0.1 8.60±2.26** 80.54±22.73** 206.58±21.46**冬蟲夏草高劑量 1 9.12±2.55** 70.38±20.82* 188.72±22.64*冬蟲夏草中劑量 0.5 9.17±2.16** 67.26±20.61* 182.16±22.31*冬蟲夏草低劑量 0.25 9.52±2.65* 58.36±12.21 176.33±18.72

通過對表5 數(shù)據(jù)進行方差分析，與空白組比較，模型組動物腦組織中MDA 含量明顯升高，GSH-Px、SOD活性明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中、低劑量組動物腦組織中MDA 含量明顯降低，高、中劑量組動物腦組織中GSH-Px、SOD 活性明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中、低劑量可明顯降低動物腦組織中MDA 含量，高、中劑量可明顯升高GSH-Px、SOD活性。

2.5 冬蟲夏草對動物肝臟組織中SOD、GSH-Px mRNA表達的影響

各組動物肝臟組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平見圖1、圖2。通過對圖1、圖2 數(shù)據(jù)進行方差分析，與空白組比較，模型組動物肝組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平明顯降低；與模型組比較，冬蟲夏草高、中劑量組動物肝組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平明顯升高，差異有顯著性。表明冬蟲夏草高、中劑量可明顯升高動物肝組織中SOD、GSH-Px mRNA 表達水平。

圖1 各組小鼠肝臟組織中SOD mRNA 表達Fig.1 The SOD mRNA expression in liver of each group mice

圖2 各組小鼠肝臟組織中GSH-Px mRNA 表達Fig.2 The GSH-Px mRNA expression in liver of each group mice

3 結論與討論

D-半乳糖氧化損傷模型，是研究抗氧化藥物的經(jīng)典模型[13]，并作為研究抗氧化功能保健食品指定的造模方法。連續(xù)大劑量皮下注射D-半乳糖后，在小鼠機體細胞內由醛糖還原酶催化，還原生成半乳糖醇，半乳糖醇不能被細胞進一步代謝，在細胞內大量堆積，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹和功能障礙[14-15]，最終會引起機體代謝紊亂、抗氧化物質活性下降、自由基堆積，從而產(chǎn)生氧化損傷效應。本實驗通過皮下注射D-半乳糖構建小鼠氧化損傷模型，研究冬蟲夏草的體內抗氧化活性。與空白組相比，模型組小鼠血清、肝臟和腦組織中的MDA 含量明顯升高，GSH 含量明顯降低，SOD、GSH-Px、T-AOC 活力明顯下降。表明氧化損傷小鼠模型構建成功。

MDA 是細胞膜脂質過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量可反映機體內脂質過氧化程度，蛋白羰基是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，可直接反映蛋白質的損傷程度[16]；GSH 是一種低分子清除劑，可清除O2-自由基、H2O2、LOOH，其含量多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。SOD 主要催化O2-自由基生成H2O2，再由其他抗氧化酶如GSH-Px 和過氧化氫酶作用生成水，其酶活性高低反應機體清除自由基能力[17]；GSH-Px 是體內存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的系統(tǒng)，對防止體內自由基引起膜脂質過氧化至關重要，SOD 和GSH-Px 兩者之間明顯存在著相互保護作用和協(xié)同抗氧化作用[18]?？偪寡趸芰Γ═-AOC）代表機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機體自由基的代謝狀態(tài)，是反應機體抗氧化能力的良好指標，可從整體上反映機體的抗氧化能力[19]。因此，通過檢測體內MDA、蛋白質羰基、GSH 含量以及 SOD、GSH-Px、T-AOC 活性可全面了解體內自由基的產(chǎn)生和清除情況。本研究結果顯示，與模型組比較，冬蟲夏草能明顯降低動物血清中MDA 蛋白質羰基含量，升高GSH 含量，明顯升高動物血清中GSH-Px、SOD、T-AOC 活性，對于肝臟和腦組織，冬蟲夏草也均能明顯降低其中的MDA 含量，升高GSH-Px、SOD 活性，表明冬蟲夏草具有明顯的體內抗氧化能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草能明顯促進小鼠肝臟中SOD、GSH-Px mRNA 的表達水平，這與對應的抗氧化酶活力增強結果相一致。

綜上所述，冬蟲夏草對氧化損傷小鼠體內抗氧化能力有明顯增強作用，其機制可能與攝入冬蟲夏草后，體內的相關抗氧化酶基因mRNA 表達上調，使得SOD、GSH-Px 抗氧化酶活力增強，機體獲得較高清除自由基的能力，從而降低體內脂質和蛋白質過氧化損傷有關。