酶解制備褐藻寡糖工藝優(yōu)化及活性研究

陳淑瓊，李曉月，吳晨爍，嚴(yán)芬

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350108）

褐藻膠是β-D 甘露糖醛酸和其C-5 差向異構(gòu)體α-L 甘露糖醛酸通過(guò)1，4-糖苷鍵連接而成的[1]。主要從海帶、馬尾藻等褐藻植物的細(xì)胞壁中提取的一種酸性直鏈多糖，但因其凝膠性強(qiáng)、黏度大、水溶性較低，導(dǎo)致應(yīng)用有一定的局限性[2]。

褐藻寡糖是褐藻膠的寡聚物，是一種具有較強(qiáng)的溶解性、易吸收、安全無(wú)毒的化合物，研究表明其具有抗氧化活性[3]、抑菌活性[4]、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[5]、治療人類(lèi)疾病[6]等作用。目前主要以化學(xué)法和酶解法制備褐藻寡糖，但化學(xué)法存在反應(yīng)條件難控制、產(chǎn)物難分離、殘留物質(zhì)難清除的問(wèn)題，使得其應(yīng)用具有很大的局限性。酶解法因其具有較強(qiáng)的特異性、提取效率較高、反應(yīng)條件較溫和、降解過(guò)程比較容易控制等優(yōu)點(diǎn)將逐漸成為制備褐藻寡糖的主要方法[7]。

本研究采用茶文化與健康研究所篩選獲得的海洋來(lái)源黃桿菌B2 發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶，再以所得褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以體系中還原糖的生成量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法對(duì)褐藻膠裂解酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高還原糖的生成量，并研究酶解制備的褐藻寡糖的ABTS+自由基清除能力、抑菌能力和對(duì)對(duì)蝦的多酚氧化酶活性的影響，為褐藻寡糖的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黃桿菌 （Flavobacterium）B2、假單胞菌（Pseudomonas）、希瓦氏菌（Shewanella）：由茶文化與健康研究所實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏；南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）由福清市誼華水產(chǎn)食品有限公司提供，并于當(dāng)天?；钸\(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

三氯乙酸、磷酸二氫鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）和植酸（70%）、苯酚、硫酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉：英國(guó)OXOID 公司；海藻酸鈉（食品級(jí)）：Aladdin 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-70BS 型氣浴式恒溫?fù)u床：上海知楚儀器公司；JJ500 型電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；TCL-20000cR 型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；STARTER 2100 型pH 計(jì)：奧豪斯儀器有限公司；YXQLS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)設(shè)備廠；SYNERGY-H1 型酶標(biāo)儀：BioTek 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

2216E 培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母粉1.0 g，三氯化鐵0.01 g，用人工海水溶解并定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：海藻酸鈉5.0 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，pH 7.2，人工海水溶解并定容至1 000 mL，121 ℃ 滅菌 20 min。

1.3.2 制備褐藻膠裂解酶粗酶液并測(cè)定酶活

挑取單菌落的黃桿菌B2 接種于液體培養(yǎng)基2216E 中，震蕩培養(yǎng) 16 h（30 ℃、180 r/min），再以轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)基體積的3 %接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 36 h（30 ℃、180 r/min），離心（4 ℃、10 000 r/min）10 min，收集上清液。上清液在4 ℃條件下加硫酸銨至60 %飽和度，4 ℃靜置過(guò)夜，離心（4 ℃、11 000 r/min）10 min，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液（pH 8.0、20 mmol/L）溶解并透析。透析后的樣品即粗酶液，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[8]測(cè)定酶活后于4 ℃貯藏備用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1）稱取一定質(zhì)量的褐藻酸鈉溶于磷酸鹽緩沖液（pH 8.0、20 mmol/L）中，配制成 2 g/L 的褐藻酸鈉溶液，從中取100mL溶液，加入20mL的粗酶液（酶活為21 U/mL）在 40 ℃下反應(yīng) 18 h，每 2 h 取 10mL酶解液，立即沸水浴10 min 終止反應(yīng)，測(cè)定還原糖生成量并計(jì)算褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率，以加入20mL滅活酶液作空白對(duì)照。

2）在反應(yīng)溫度 40 ℃、pH 8.0 條件下，研究不同底物濃度（2、4、6、8、10、12 g/L）在褐藻酸鈉水解過(guò)程中對(duì)還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率的影響。

3）在底物濃度8 g/L、反應(yīng)溫度40 ℃條件下，研究不同酶解液 pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）在褐藻酸鈉水解過(guò)程中對(duì)還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率的影響。

4）在底物濃度 8 g/L、pH 8.0 的條件下，研究不同溫度（20、30、40、50、60 ℃）在褐藻酸鈉水解過(guò)程中對(duì)還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量及水平。根據(jù)中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）原理，以還原糖生成量為指標(biāo)，選取溫度、pH 值兩個(gè)因素，設(shè)計(jì)兩因素五水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，用響應(yīng)面分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，來(lái)確定最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及水平表Table 1 Factors and level of response surface central composite design

1.3.5 還原糖生成量測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定還原糖生成量[8]。

1.3.6 轉(zhuǎn)化率測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定體系中的總糖濃度[9]，還原糖含量與總糖含量的比值，即為體系的轉(zhuǎn)化率。

1.3.7 ABTS+自由基清除活力

參照Wang 等[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。蒸餾水作為空白組，維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算ABTS+自由基清除活力。

1.3.8 不同濃度的褐藻寡糖的抑菌指數(shù)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取褐藻寡糖的濃度梯度：4、6、8、10、12 g/L，以對(duì)對(duì)蝦腐敗菌假單胞菌和希瓦氏菌按體積比1∶1 混合的菌液的抑菌指數(shù)為考察指標(biāo)。按混合菌液體積的3%的比例將褐藻寡糖加入混合菌液后震蕩培養(yǎng)8 h，在600 nm 處測(cè)定吸光值，計(jì)算抑菌指數(shù)，確定各成分的最佳濃度。同時(shí)，設(shè)置無(wú)菌水為空白對(duì)照組，平行測(cè)定4 次。抑菌指數(shù)公式為：

式中：Acontrol表示空白組吸光值；Asample表示樣品組吸光值。

1.3.9 對(duì)蝦的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性測(cè)定

將購(gòu)買(mǎi)的對(duì)蝦，保活運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，加碎冰使其猝死，清洗干凈后，剔除肢體殘缺、顏色異常的個(gè)體；挑選大小一致的對(duì)蝦隨機(jī)放入預(yù)冷的蒸餾水中，避光浸泡1 h。瀝干后隨機(jī)分組放入自封袋中，放置（4±1）℃條件下貯藏。取20 只蝦頭，用液氮研磨至粉末，50 mmol/L pH 6.8 的磷酸鹽溶液溶解，4 ℃離心30 min 得到的上清液即為PPO 粗酶液。測(cè)定酶活之前，預(yù)先在1mL酶液中分別加入100 μL 的褐藻寡糖、植酸（蒸餾水為空白對(duì)照）35 ℃孵育30 min，再于470 nm 處測(cè)定吸光值。多酚氧化酶的酶活測(cè)定參照González 等[11]的方法。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 及Origin 8.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件單因素優(yōu)化

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)降解效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響見(jiàn)圖1。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on sodium alginate hydrolysis

酶解時(shí)間影響酶解產(chǎn)物的得率，酶解時(shí)間太短，酶解反應(yīng)就不夠充分，當(dāng)酶解反應(yīng)已達(dá)到平衡時(shí)，增加酶解時(shí)間也不能明顯提高酶解產(chǎn)物的生成量和轉(zhuǎn)化率。由圖1 可知，酶解過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，酶解反應(yīng)還原糖生成量及褐藻酸鈉的轉(zhuǎn)化率也隨之升高，酶解16 h 后，還原糖生成量及轉(zhuǎn)化率趨于平穩(wěn)，表明酶解16 h 時(shí)褐藻酸鈉基本已經(jīng)酶解為寡糖，繼續(xù)進(jìn)行酶解還原糖生成量和轉(zhuǎn)化率也不會(huì)增加太多，因此選擇16 h 為褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉制備褐藻寡糖的最佳酶解時(shí)間。

2.1.2 底物濃度對(duì)降解效果的影響

底物濃度對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 底物濃度對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on sodium alginate hydrolysis

隨著底物濃度逐漸增大，還原糖生成量也不斷增加。當(dāng)?shù)孜餄舛仍鲋? g/L 時(shí)，褐藻酸鈉轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，而后還原糖生成量和轉(zhuǎn)化率基本穩(wěn)定。這是因?yàn)楹衷逅徕c的水溶液具有高黏度特性，且溶液黏度呈幾何級(jí)數(shù)上升，在較高的底物濃度下，酶量明顯不足，不利于酶與底物的充分接觸[12]，減弱了酶解底物的速度，使還原糖的生成量和轉(zhuǎn)化率變低，因此選擇褐藻酸鈉濃度為8 g/L 為最佳底物濃度。

2.1.3 溫度對(duì)降解效果的影響

溫度對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響見(jiàn)圖3。

溫度能夠影響酶的活性，在酶解反應(yīng)中起很重要的作用。一定溫度范圍內(nèi)，酶活力隨著溫度的升高而升高，當(dāng)達(dá)到酶的最適溫度時(shí)，此時(shí)酶的酶活力達(dá)到最大，酶解效果最好；當(dāng)溫度逐漸升高超過(guò)了最適溫度時(shí)，酶蛋白質(zhì)會(huì)因?yàn)檫^(guò)高的溫度而變性失活，酶活力的降低，影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)程。如圖3 所示，還原糖生成量及褐藻酸鈉轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而升高，并在反應(yīng)溫度30 ℃時(shí)達(dá)到最大值；而當(dāng)溫度大于30 ℃，二者隨溫度的升高而降低。結(jié)果表明，褐藻膠裂解酶在30 ℃時(shí)酶活力最大，降解海藻酸鈉效果最好，故褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉制備褐藻寡糖的最佳反應(yīng)溫度應(yīng)選擇30 ℃。

圖3 溫度對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperatures on sodium alginate hydrolysis

2.1.4 pH 值對(duì)降解效果的影響

pH 值對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH 值對(duì)褐藻酸鈉水解效果的影響Fig.4 Effect of pH value on sodium alginate hydrolysis

圖4 表明褐藻膠裂解酶對(duì)pH 值變化敏感，當(dāng)pH值為8.0 時(shí)，還原糖生成量及褐藻酸鈉轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，當(dāng)體系pH 值偏離最適pH 值時(shí)，二者都會(huì)出現(xiàn)不同程度地減小。這與酶自身的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)，即酶在一定的pH 值范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大活力，當(dāng)酶處于最適pH 值時(shí)，其酶活力最大，酶解速度最快，酶解效果最好，偏離最適pH 值時(shí)，酶的活性中心構(gòu)像會(huì)產(chǎn)生一定的變化，甚至于改變了整個(gè)酶分子的結(jié)構(gòu)，從而使酶變性失活[13]，酶活力的下降，影響了酶解反應(yīng)的進(jìn)程，減弱了酶解速度，還原糖生成量及轉(zhuǎn)化率也大大下降，故最佳反應(yīng)pH 值應(yīng)為8.0。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到，還原糖生成量或轉(zhuǎn)化率具有顯著差異的是pH 值和溫度。由于溫度和pH 值是褐藻膠裂解酶酶的特定屬性，酶活力對(duì)溫度和pH 值較為敏感，當(dāng)溫度和pH 值改變時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致酶失活，因此選擇這兩個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用響應(yīng)面法（RSM），所用軟件為Design-Expert 8.0.6，實(shí)施模型為中心組合設(shè)計(jì)。響應(yīng)面CCD 設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface design and corresponding results

利用軟件進(jìn)行回歸分析，得到響應(yīng)值Y 還原糖生成量的多項(xiàng)式回歸模型為：Y=1 648.37+163.86A+30.17B-62.87AB-215.54A2-52.98B2，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 中心組合試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance（ANOVA）of central composite design

回歸方程方差分析顯示，模型的P＜0.000 1 說(shuō)明該模型顯著，失擬項(xiàng)P=0.090 5＞0.05，表明失擬不顯著，模型沒(méi)有失擬現(xiàn)象，說(shuō)明該模型的選擇是合理可行的。決定系數(shù)R2=0.981 5，說(shuō)明實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值擬合度良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.968 4，表明僅有總變異的不到4%不能由該模型解釋；本試驗(yàn)變異系數(shù)=2.63%，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠。精密度為35.425 大于4，說(shuō)明該模型可以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合。

響應(yīng)面各試驗(yàn)點(diǎn)預(yù)測(cè)值和真實(shí)值線性關(guān)系見(jiàn)圖5。

圖5 響應(yīng)面各試驗(yàn)點(diǎn)預(yù)測(cè)值和真實(shí)值線性關(guān)系圖Fig.5 Linear correlation plot between predicted and actual values of tannasecontent of response surface model

如圖5 所示，軟件擬合的響應(yīng)面各試驗(yàn)點(diǎn)預(yù)測(cè)值和真實(shí)值擬合程度良好。該擬合方程為褐藻膠裂解酶水解制備褐藻寡糖提供了一個(gè)合適的模型，可用此模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)酶解反應(yīng)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

根據(jù)上述擬合的回歸方程，利用Design-Expert 8.0.6 軟件繪制出的三維響應(yīng)面及與之對(duì)應(yīng)的等高線圖見(jiàn)圖6。

圖6 的溫度和體系pH 值對(duì)還原糖生成量的影響的響應(yīng)面及等高線圖能比較直觀地解釋各變量之間對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱。圖6 顯示了溫度和體系pH 值對(duì)還原糖生成量的影響。當(dāng)溫度不變時(shí)，還原糖生成量會(huì)隨體系pH 值的增大出現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)；當(dāng)體系pH值不變時(shí)，還原糖生成量同樣會(huì)出現(xiàn)先增大再降低的趨勢(shì)。因此預(yù)測(cè)該試驗(yàn)存在一個(gè)最大值，通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件預(yù)測(cè)還原糖生成量的最大值為1 680 mg/L，最佳試驗(yàn)條件是體系pH 值為8.37，溫度為30.65 ℃。

圖6 體系pH 值和溫度對(duì)還原糖生成量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface curves and contour plots of interaction effect between enzyme dosage and pH value

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)以上最佳工藝條件，取實(shí)際可控的條件：體系pH 8.4、酶解溫度30 ℃、底物質(zhì)量濃度8 g/L，該條件下酶解制備褐藻寡糖，經(jīng)測(cè)定，其還原糖生成量為1 660 mg/L。略低于響應(yīng)面試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值，但誤差僅在1.20%之間，證明了響應(yīng)面所得的模型及最佳條件的可靠性。

2.4 褐藻寡糖對(duì)ABTS+自由基的清除能力

ABTS 在適當(dāng)?shù)难趸瘎┤邕^(guò)硫酸鉀氧化作用下會(huì)形成藍(lán)綠色的單陽(yáng)離子自由基（ABTS+自由基），當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，ABTS+自由基的產(chǎn)生將受到抑制。表4可以看出，褐藻寡糖表現(xiàn)出良好的清除活性，清除能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。且當(dāng)濃度增至5.0 g/L 時(shí)，達(dá)到與維生素C 同等的清除效果。對(duì)蝦腐敗的原因之一是由于氧氣的作用，結(jié)果表明酶解得到的褐藻寡糖有較強(qiáng)的抗氧化能力，因此褐藻寡糖可以減少氧化作用延長(zhǎng)對(duì)蝦的貨架期。

表4 褐藻寡糖對(duì)ABTS+自由基清除活性Table 4 Scavenging effect of alginate oligosaccharides on ABTS+

2.5 不同濃度的褐藻寡糖的抑菌指數(shù)

不同濃度的褐藻寡糖的抑菌指數(shù)見(jiàn)圖7。

圖7 不同濃度褐藻寡糖的抑菌指數(shù)Fig.7 Different concentrations of alginate oligosaccharide antibacterial index

從圖7 可知，當(dāng)褐藻寡糖濃度達(dá)到8 g/L 時(shí)，對(duì)對(duì)蝦的腐敗菌的抑菌指數(shù)達(dá)到了最大；隨著褐藻寡糖濃度的增加，抑菌指數(shù)變低的原因可能是由于褐藻膠裂解酶的降解能力具有一定的限度，對(duì)底物海藻酸鈉降解不完全，而海藻酸鈉可以作為碳源促進(jìn)對(duì)蝦腐敗菌的生長(zhǎng)，削弱了褐藻寡糖的抑菌效果。綜合以上分析，選擇褐藻寡糖濃度為8 g/L 時(shí)對(duì)對(duì)蝦的腐敗菌希瓦氏菌和假單胞菌的抑菌能力最大，抑菌效果最好。

2.6 褐藻寡糖對(duì)對(duì)蝦蝦頭PPO活性影響

各物質(zhì)對(duì)對(duì)蝦蝦頭PPO 活性的影響見(jiàn)圖8。

圖8 各物質(zhì)對(duì)對(duì)蝦蝦頭PPO 活性的影響Fig.8 Effect of different material on PPO activity

由圖8 可知，向PPO 粗酶液中添加褐藻寡糖、植酸后PPO 活性顯著低于對(duì)照組，表明這2 種物質(zhì)可以有效抑制多酚氧化酶活性。由于PPO 可以誘導(dǎo)蝦體內(nèi)的無(wú)色一元酚與氧氣接觸，逐步氧化成有色醌類(lèi)物質(zhì)，造成褐變，因此保鮮劑中含有褐藻寡糖或植酸這兩種物質(zhì)可以減輕對(duì)蝦的褐變反應(yīng)，提高感官評(píng)價(jià)分值。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用單因素與響應(yīng)面相結(jié)合的方法對(duì)褐藻膠裂解酶酶解褐藻酸鈉的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳的酶解條件為：體系pH 8.4、酶解溫度30 ℃、底物質(zhì)量濃度8 g/L，該條件下還原糖生成量達(dá)到1 660 mg/L，比優(yōu)化前提高了64.9%。當(dāng)褐藻寡糖濃度達(dá)到5.0 g/L時(shí)，可達(dá)到與維生素C 同等的ABTS+自由基清除效果，表明褐藻寡糖具有較強(qiáng)的抗氧化作用，當(dāng)褐藻寡糖濃度達(dá)到8 g/L 時(shí)，對(duì)對(duì)蝦的腐敗菌希瓦氏菌和假單胞菌的抑菌指數(shù)達(dá)到了最大，表明褐藻寡糖對(duì)對(duì)蝦的腐敗菌生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，將其作用于蝦頭中提取的多酚氧化酶發(fā)現(xiàn)能有效的抑制多酚氧化酶的活性，為酶解褐藻酸鈉制備的褐藻寡糖的開(kāi)發(fā)和對(duì)對(duì)蝦的貯藏保鮮研究提供了理論依據(jù)。