Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)

石征宇,魯晶娣,韋盤秋,伍時(shí)華,程謙偉,黎 婭,易 弋,*

(1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西柳州 545006; 2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西科技大學(xué)),廣西柳州 545006; 3.廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西科技大學(xué)),廣西柳州 545006)

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)又稱蜜二糖酶,屬于外切糖苷酶類,能夠?qū)Ｒ淮呋擎溎┒撕?1.6半乳糖苷鍵的多糖、糖蛋白、糖脂等物質(zhì)[1],既能催化毛蕊花糖、棉籽糖、水蘇糖和蜜二糖等低聚糖,又能催化一些含α-半乳糖苷鍵的雜多糖。α-半乳糖苷酶在自然界中分布廣泛,主要存在于人、動(dòng)植物及微生物體內(nèi),其中以植物來源研究較多,如水稻[2]、黃瓜[3]、咖啡豆[4]等;微生物來源主要有嗜熱脂肪芽孢桿菌[5]、長雙歧桿菌[6]、臭曲霉[7]等;此外,在各種哺乳動(dòng)物體內(nèi),其組織勻漿中也含有α-半乳糖苷酶,尤其在人和鼠的甲狀腺和腎臟等部位,α-半乳糖苷酶活性最高[8]。α-半乳糖苷酶具有多種用途,主要應(yīng)用于飼料加工、食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。某些α-半乳糖苷酶在底物濃度較高時(shí),具有轉(zhuǎn)半乳糖基作用,利用這一特點(diǎn)可將其用于低聚糖的合成及環(huán)糊精衍生物的制備[9]。

豆科植物富含蛋白質(zhì),是很好的蛋白質(zhì)飼料來源,但豆科植物中存在α-半乳糖苷等抗?fàn)I養(yǎng)因子,且這類物質(zhì)用普通方法很難將其降解,當(dāng)其在動(dòng)物體內(nèi)大量積累時(shí),會(huì)影響機(jī)體的代謝能力,降低對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[10],嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起脹氣、厭食、腹瀉等不良癥狀[11]。利用α-半乳糖苷酶的水解特點(diǎn),在飼料加工過程中添加α-半乳糖苷酶,能夠有效地降低α-半乳糖苷類抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在,從而促進(jìn)動(dòng)物的生長[12]。

在飼料加工過程中,常涉及到高溫環(huán)節(jié),這會(huì)對(duì)酶造成不可逆的失活,因此提高α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性是該酶在飼料工業(yè)大規(guī)模應(yīng)用中必須解決的問題。目前,嗜熱微生物依舊是熱穩(wěn)定性酶最直接和最可靠的來源[13]。Geobacillusthermodenitrificans是一種嗜熱的革蘭氏染色陽性細(xì)菌,好氧或兼性厭氧,屬于Geobacillus屬[16]。目前,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)該菌的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù),人工設(shè)計(jì)Geobacillusthermodenitrificans(NG80-2)的α-半乳糖苷酶編碼基因,并在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá),然后對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,旨在獲得具有良好熱穩(wěn)定性的α-半乳糖苷酶,并為該酶的工業(yè)化應(yīng)用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌BL21(DE3)、載體pGEX-4T-3 為本實(shí)驗(yàn)室保存;T4 DNA Ligase、DNA marker DL 5000 TAKARA公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I Thermo Fisher;甘氨酸(Glycine)、氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 北京索萊寶科技有限公司;對(duì)硝基苯酚(4-nitrophenol) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNPG) 上海源葉科技有限公司;對(duì)硝基苯酚(pNP) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;Yeast Extract OXOID公司;GST瓊脂糖凝膠FF 北京韋氏博慧色譜科技有限公司;McIlvaine緩沖液:Na2HPO414.626 g、C4H2O7·H2O 10.19 g,定容至1 L;PBS緩沖液:NaCl 8.006 g,KCl 0.201 g,KH2PO40.24 g,Na2HPO4·12H2O 3.581 g,ddH2O定容至1 L,調(diào)節(jié)pH至7.4;洗脫 buffer 1:Tris 0.61 g,NaCl 0.9 g,ddH2O定容至100 mL,調(diào)節(jié)pH至8.3;洗脫buffer 2:Tris 0.61 g,還原性谷胱甘肽0.614 g,ddH2O定容至100 mL,調(diào)節(jié)pH至8.3。

SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器;UV-8000S紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;H2100R醫(yī)用離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;Tpersonal PCR儀 Biometra;S220多參數(shù)測試儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BL0N-1000Y超聲波信號(hào)發(fā)生器 上海比郎儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌的構(gòu)建Geobacillusthermodenitrificansα-半乳糖苷酶編碼基因的獲取:根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫所提供的氨基酸序列(登錄號(hào):WP_011887668),人工設(shè)計(jì)酶的編碼基因,并利用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行密碼子優(yōu)化(http://www.jcat.de/Start.jsp),同時(shí),在基因兩端分別加入EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn),送由杭州弘賽生物科技有限公司進(jìn)行合成。對(duì)載體進(jìn)行雙酶切,分別回收目的基因片段和表達(dá)載體片段,并利用T4連接酶于16 ℃連接12 h,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中,后均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)上,37 ℃培養(yǎng)14 h后,挑取陽性菌落進(jìn)行雙酶切和PCR驗(yàn)證,并送廣州英俊有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)中,37 ℃培養(yǎng)12 h后,以1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp),于37 ℃培養(yǎng),待OD600值達(dá)到0.4～0.6時(shí),加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)使其工作濃度為0.1 mmol/L,并在28 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。將誘導(dǎo)完成的菌液在10000 r/min下離心10 min,去上清,用pH7.4的PBS緩沖液洗滌菌體3次,再按1∶10的體積比將菌體重懸于PBS緩沖液中,利用超聲細(xì)胞破碎儀在冰水浴下進(jìn)行細(xì)胞破碎(200 W,工作8 s間歇8 s,共80次),破碎后的細(xì)胞液12000 r/min離心15 min,取上清液即為粗酶液,備用。

1.2.3 目的蛋白的純化 利用GST瓊脂糖凝膠柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,純化步驟如下:用洗脫 buffer 1平衡5個(gè)柱體積,將10 mL粗酶液用洗脫 buffer 1緩沖液稀釋到20 mL,0.45 μL濾膜過濾,上樣,再用洗脫 buffer 1洗10個(gè)柱體積,用洗脫 buffer 2進(jìn)行洗脫,收集洗脫液(即純酶),利用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測純化結(jié)果。

1.2.4 酶活力的測定 在pNPG法[13]的基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。將pNPG溶于McIlvaine緩沖液[14]中,使其終濃度為10 mmol/L。將5 μL純酶加入695 μL McIlvaine緩沖液中,37 ℃溫水浴5 min,加入50 μL 10 mol/L的pNPG,于相應(yīng)的條件下反應(yīng)10 min,反應(yīng)完成后,加入3.25 mL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng),于紫外可見分光光度計(jì)595 nm波長下測其OD值。按照pNG的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=213.27187x+0.17168(R2=0.9998),計(jì)算α-半乳糖苷酶酶活。酶活定義:1 min內(nèi)水解1 μmol pNPG轉(zhuǎn)化為pNG所需的酶量,單位μmol/min。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.2.5.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 分別在25～75 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),按照1.2.4的實(shí)驗(yàn)方法測定酶活,確定α-半乳糖苷酶的最適溫度;然后在45、50、55、60、65、70、75 ℃溫度下,對(duì)該酶處理不同時(shí)間(20、40、60、80、100、120、150 min),并在最適溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng),按照1.2.4的實(shí)驗(yàn)方法測定酶活。以測定的最高酶活為100%,其他酶活占最高酶活的百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)酶活。

1.2.5.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 配制pH3.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和pH9.0～10.0的Tirs-HCl緩沖液,將pNPG溶于不同的pH緩沖液中,在最適溫度下,按照1.2.4的實(shí)驗(yàn)方法測定酶活,以確定重組酶的最適pH;將酶液在不同pH的緩沖液中,70 ℃處理1、2 h,然后pH6.0及70 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),以未處理的酶液作為對(duì)照,其他酶活占最高酶活的百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)酶活。

1.2.5.3 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響 選取化合物或金屬離子Fe3+、Cu2+、K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Co2+、EDTA、Ag+、Ni+、Al3+、Hg+,以McIlvaine緩沖液配制工作濃度為0.5 mol/L的離子溶液,按1.2.4中的方法配制酶反應(yīng)體系,在最適溫度和最適pH下進(jìn)行反應(yīng)。以不添加金屬離子的酶活作為100%,其他酶活占最高酶活的百分?jǐn)?shù)即為相對(duì)酶活。

1.2.5.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定 利用McIlvaine緩沖液配制不同濃度的pNPG溶液(1、2、4、6、8、10 mmol/L),在最適條件下按1.2.4中的方法進(jìn)行反應(yīng),以測定在不同底物濃度[S]下的反應(yīng)速率V。采用雙倒數(shù)作圖法確定Km和Vmax。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-半乳糖苷酶的純化結(jié)果

蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化的電泳結(jié)果見圖1。泳道1是前期構(gòu)建的工程菌且未添加IPTG的電泳圖,從圖1中可知,在未添加IPTG時(shí),重組工程菌并不產(chǎn)生重組蛋白,而加入適量的IPTG后,α-半乳糖苷酶可在大腸桿菌宿主菌中成功表達(dá),且重組蛋白分子量大小在100～110 kDa之間,與理論值一致(GST標(biāo)簽約是26 kDa,目的蛋白約是84 kDa)。泳道5在目標(biāo)位置出現(xiàn)單一條帶,說明目標(biāo)蛋白純化效果較好。

圖1 重組蛋白純化結(jié)果Fig.1 Results of purified recombinant protein 注:M:蛋白marker;1:對(duì)照;2:誘導(dǎo)全蛋白質(zhì); 3:誘導(dǎo)上清;4:誘導(dǎo)沉淀;5:純化結(jié)果。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的測定結(jié)果

2.2.1 最適反應(yīng)溫度 圖2為溫度對(duì)α-半乳糖苷酶酶活的影響。由圖2可知,在相同的反應(yīng)體系下,溫度為30～70 ℃時(shí),α-半乳糖苷酶的酶活力隨溫度的升高而升高;在反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí),α-半乳糖苷酶酶活力達(dá)到最大,可見70 ℃為α-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度;而后隨著溫度繼續(xù)升高,α-半乳糖苷酶酶活力迅速下降,說明在高溫情況下該酶迅速失活,不宜在高于70 ℃的條件下進(jìn)行催化反應(yīng)。

圖2 溫度對(duì)α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of α-galactosidase

2.2.2 溫度穩(wěn)定性 按照上面1.2.4的反應(yīng)體系,在不同的溫度下對(duì)純酶進(jìn)行處理,最適溫度下測定剩余酶活。圖3為α-半乳糖苷酶的溫度穩(wěn)定性測定結(jié)果。從圖3可以看出,α-半乳糖苷酶在45～65 ℃處理150 min后,剩余酶活還保留在55%以上,說明該酶的較適應(yīng)催化溫度為45～65 ℃。而在70 ℃下處理80 min后,剩余酶活仍有60%以上,75 ℃處理60 min剩余酶活只有18%左右,因此該酶不宜在75 ℃及以上的高溫下長時(shí)間發(fā)揮作用。

圖3 α-半乳糖苷酶的溫度穩(wěn)定性Fig.3 Temperature stability of α-galactosidase

2.2.3 最適pH 圖4為pH對(duì)α-半乳糖苷酶酶活的影響。由圖4可知,α-半乳糖苷酶的酶活力隨環(huán)境pH的改變出現(xiàn)較大的變化。當(dāng)pH為2～4時(shí),α-半乳糖苷酶的酶活力幾乎為零;而后隨著pH的升高,酶活逐漸上升,在pH6.0時(shí)酶活力達(dá)到最大;當(dāng)酶反應(yīng)環(huán)境的pH繼續(xù)升高時(shí),α-半乳糖苷酶的酶活力逐漸下降。因此,重組α-半乳糖苷酶的最適pH為6.0。

圖4 pH對(duì)α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of α-galactosidase

2.2.4 pH穩(wěn)定性 圖5為α-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性測定結(jié)果。由圖5可知,在不同pH條件下對(duì)α-半乳糖苷酶處理1、2 h,其酶活保留率仍在70%以上,在pH5.0～6.5緩沖液中處理2 h,剩余酶活仍能達(dá)到原酶活的90%以上,在pH3.0～4.0的范圍內(nèi)處理2 h,仍具有80%以上的活力,并且處理1、2 h,α-半乳糖苷酶的剩余酶活無明顯變化。由圖5還可看出,α-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性的變化趨勢與最適pH的變化趨勢極為相似,酶活性均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并且該酶在低pH條件下穩(wěn)定性較好,說明該酶適合偏酸性的環(huán)境。

圖5 α-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of α-galactosidase

2.2.5 金屬離子及化合物對(duì)α-半乳糖苷酶的影響 金屬離子對(duì)α-半乳糖苷酶酶活的影響結(jié)果見圖6。從圖6可知,Cu2+、Ag+、Hg+能夠完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,而Fe3+、Ca2+、Mn2+、Zn2+對(duì)α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用,其中以Zn2+對(duì)α-半乳糖苷酶的激活效果最好,EDTA、K+、Na+、Al3+、Ni+等離子對(duì)α-半乳糖苷酶酶活性影響不大。

圖6 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)α-半乳糖苷酶酶活的影響Fig.6 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of α-galactosidase

2.2.6α-半乳糖苷酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定結(jié)果 按照米氏方程,采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測定α-半乳糖苷酶的Km和Vmax,結(jié)果如圖7所示。在最佳反應(yīng)條件下,α-半乳糖苷酶的Km為10.04 mmol/L,Vmax為18.25 μmol/min。

圖7 α-半乳糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curve of α-galactosidase

3 討論

Geobacillusthermodenitrificans屬于Geobacillus屬[15],Geobacillus屬的菌株多分布在火山、油田、干草堆等高溫環(huán)境,具有嗜熱、降解烴等應(yīng)用價(jià)值,由于所處環(huán)境特殊,這類細(xì)菌可能具有某些特種酶或特殊功能的基因。本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)來源于Geobacillusthermodenitrificans的α-半乳糖苷酶編碼基因進(jìn)行了重組表達(dá),利用GST瓊脂糖凝膠柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示,重組α-半乳糖苷酶分子量為100～110 kDa。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示,重組α-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃,與其它研究所報(bào)道的α-半乳糖苷酶的最適溫度相比較高,李蘇紅等[2]研究重組水稻α-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃;陳俊亮等[6]研究長雙歧桿菌α-半乳糖苷酶,結(jié)果顯示該酶的最適反應(yīng)溫度為42 ℃。本研究得到重組α-半乳糖苷酶的最適pH為6.0,這與大多數(shù)的研究結(jié)果相近[14],并且重組酶在pH3.0～4.0的范圍內(nèi)處理2 h,仍具有80%以上的活力,說明該酶可在偏酸性條件下長時(shí)間發(fā)揮催化作用。

不同金屬離子對(duì)酶分子活性呈現(xiàn)出不同的特性,有的可以使酶的活性降低甚至喪失,有的卻可以使酶活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。在本研究中,Hg+能夠強(qiáng)烈抑制α-半乳糖苷酶的活性,這與陳俊亮等人報(bào)道的Hg+是α-半乳糖苷酶的抑制劑相符[6]。Hg+之所以能夠抑制α-半乳糖苷酶的活性,可能是因?yàn)樵谠撁傅拇呋稽c(diǎn)附近含有半胱氨酸殘基,Hg+通過與半胱氨酸殘基殘基側(cè)鏈上的巰基發(fā)生作用,從而抑制α-半乳糖苷酶的活性[16]。有研究報(bào)道指出,Ag+對(duì)α-半乳糖苷酶表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的抑制作用[17],這與本研究結(jié)果一致,Ag+對(duì)α-半乳糖苷酶的抑制作用,可能是因?yàn)樵谠撁傅幕钚灾行奈恢?存在組氨酸或含有羧基的氨基酸[18]。Mn2+、Zn2+、Fe3+等離子對(duì)酶活有激活作用,以Zn2+離子最為顯著,其原因可能是,通過電荷間的相互作用增加了鹽橋的數(shù)量,鹽橋間相互交聯(lián)產(chǎn)生了穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。K+和Na+離子對(duì)α-半乳糖苷酶活性無明顯影響,可能是因?yàn)镵+、Na+等離子是胞內(nèi)外常見離子,其生物學(xué)作用主要是維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓以及中和陰離子的電荷。EDTA作為一種常見的金屬離子絡(luò)合劑,通過與酶活中心的金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,進(jìn)而影響酶的催化效率,但在本研究中發(fā)現(xiàn)EDTA對(duì)酶活性的影響很小,這與李蘇紅[2]、密士軍[16]等人的研究結(jié)果相一致,這可能是因?yàn)樵撁傅幕钚灾行牟⒉淮嬖诮饘匐x子輔基,進(jìn)而不能與EDTA形成絡(luò)合物。

通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法得到,α-半乳糖苷酶的Km為10.04 mmol/L,Vmax為18.25 μmol/min,這與沈汪洋等[4]測定的咖啡豆α-半乳糖苷酶的Km=0.556 mmol/L、Vmax=1.19 μmol/min有較大的差別[4],通過對(duì)比Km值發(fā)現(xiàn),咖啡豆α-半乳糖苷酶對(duì)底物的親和能力強(qiáng)于本研究α-半乳糖苷酶,但最大反應(yīng)速率低于本研究。

4 結(jié)論

對(duì)重組工程菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo),并對(duì)破包后的粗酶液進(jìn)行GST瓊脂糖凝膠柱純化,經(jīng)SDS-PAGE后測得重組蛋白的分子量為100～110 kDa。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明,重組α-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃,最適pH為6.0,并且重組酶在pH3.0～4.0的范圍內(nèi)處理2 h,仍具有80%以上的活力,說明該酶可在偏酸性條件下長時(shí)間發(fā)揮催化作用,Cu2+、Ag+、Hg+能夠完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,而Fe3+、Ca2+、Mn2+、Zn2+對(duì)α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用,其中以Zn2+對(duì)α-半乳糖苷酶的激活效果最好,在最佳反應(yīng)條件下測得α-半乳糖苷酶的Km為10.04 mmol/L,Vmax為18.25 μmol/min。目前,耐熱α-半乳糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)尚未實(shí)現(xiàn),因此發(fā)掘性質(zhì)優(yōu)良的α-半乳糖苷酶迫在眉睫。與其它已報(bào)道的α-半乳糖苷酶相比,本研究的重組α-半乳糖苷酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),較其他來源的α-半乳糖苷酶有更好的應(yīng)用前景。