聚乙二醇定點修飾β-乳球蛋白谷氨酰胺殘基條件優(yōu)化及其對蛋白抗原性的影響

羅舜菁 甘克明 陸旭麗 成娜娜 劉成梅

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)是乳清蛋白的主要成分，在乳清蛋白中的含量約為43.6～50.0%[1]。天然的β-LG也是牛乳中最主要的過敏原之一[2]，對牛乳過敏的患者中約82%的人會對β-LG產(chǎn)生過敏反應(yīng)[3-4]。消除或降低牛乳致敏性的最有效方法是將過敏原物質(zhì)從牛乳中分離，將牛乳中β-LG去除后可以模擬人乳，可用于嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)[5]。β-LG具有較高的營養(yǎng)價值及多種功能特性，如溶解性、起泡性和凝膠性等，因而在食品加工中具有較大的應(yīng)用價值[6]，而其強(qiáng)致敏性使其應(yīng)用范圍受到了極大限制[2]。針對從牛乳中分離出的β-LG，為降低其致敏性，進(jìn)行了大量的研究，其中，化學(xué)修飾技術(shù)如糖基化[7]、聚乙二醇修飾[8]等是目前研究的熱點。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾多用于藥物蛋白的修飾，以改善蛋白的生物化學(xué)特性、降低抗原性等[9]。分子量在1 000 Da以上的PEG無毒，且已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于食品、藥品和化妝品中[8,10]。目前，應(yīng)用PEG隨機(jī)修飾來降低β-LG抗原性的研究[11-12]已有少量報道。然而，PEG隨機(jī)修飾通常會得到多種PEG修飾產(chǎn)物的混合物，難以分離純化和表征其性質(zhì)[13]。此外，PEG隨機(jī)修飾的修飾位點難以確定，使β-LG的修飾位點與抗原性間關(guān)系的研究存在較大困難。在隨機(jī)修飾條件下，蛋白結(jié)構(gòu)也會發(fā)生較大改變[8]。綜上所述，應(yīng)用PEG隨機(jī)修飾難以對β-LG的抗原性變化機(jī)理進(jìn)行深入探究，因而也難以對其抗原性進(jìn)行有效調(diào)控。酶催化PEG定點修飾技術(shù)可在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG酶)的催化下，對蛋白質(zhì)谷氨酰胺殘基(Gln)進(jìn)行定點修飾[14]，得到的修飾產(chǎn)物均一[15]，且修飾條件溫和，因而對蛋白構(gòu)象的影響較小。

本研究擬在TG酶催化下用5 kDa mPEG-NH2定點修飾β-LG的Gln殘基，通過SDS-PAGE結(jié)合凝膠過濾色譜對修飾條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)陽離子交換色譜對修飾產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，用SDS-PAGE和反相高效液相色譜(RP-HPLC)對修飾產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，通過間接競爭ELISA法對修飾前后的蛋白進(jìn)行抗原性分析，以期開發(fā)有效降低β-LG 抗原性的方法，為進(jìn)一步研究其抗原性變化機(jī)理提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛乳β-乳球蛋白、豬明膠：美國Sigma公司；

單甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)：5 kDa，北京鍵凱科技股份有限公司；

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)：200 U/g，上海源葉生物科技有限公司；

十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Glycine)、4×上樣緩沖液(含β-巰基乙醇)、考馬斯亮藍(lán)R250：北京索萊寶科技有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸鈉、氯化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、鄰苯二胺、無水乙醇、冰醋酸、甲醇：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

三氟乙酸、乙腈：色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

吐溫-20、30%過氧化氫、濃硫酸：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

垂直電泳儀：Mini-PROTEIN Tetra型，美國伯樂公司；

中高壓層析系統(tǒng)：NGC Quest 10 Plus型，美國伯樂公司；

酶標(biāo)儀：HF2000型，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；

電子分析天平：ME104型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計：Five Easy Plus型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：Heraeus Multifuge X1R型，美國Thermo公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2型，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；

超純水系統(tǒng)：Simplicity UV型，美國Millipore公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 mPEG-NH2定點修飾β-LG谷氨酰胺殘基 根據(jù)Mero等[9]的方法，修改如下：將β-LG溶解在一定pH值且含有一定量乙醇的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，使其濃度為1.0 mg/mL。依次按一定量β-LG與PEG摩爾比及TG酶與β-LG質(zhì)量比(E/S)加入5 kDa的mPEG-NH2和TG酶，攪拌均勻后，在一定溫度下反應(yīng)12 h，用冰醋酸調(diào)pH至4.5終止反應(yīng)。

1.2.2 單因素試驗

(1) TG酶與β-LG質(zhì)量比：按1.2.1方法，β-LG與PEG摩爾比1∶10，緩沖液中乙醇添加量25%(體積分?jǐn)?shù))，反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)溫度25 ℃，考察TG酶與β-LG質(zhì)量比(5∶1，3∶1，1∶1，1∶3)對修飾率的影響。

(2) 反應(yīng)pH：按1.2.1方法，TG酶與β-LG質(zhì)量比1∶1，β-LG與PEG摩爾比1∶10，緩沖液中乙醇添加量25%(體積分?jǐn)?shù))，反應(yīng)溫度25 ℃，考察反應(yīng)pH(5.0，6.0，7.0，8.0)對修飾率的影響。

(3)β-LG與PEG摩爾比：按1.2.1方法，TG酶與β-LG質(zhì)量比1∶1，反應(yīng)pH 7.0，緩沖液中乙醇添加量25%(體積分?jǐn)?shù))，反應(yīng)溫度25 ℃，考察β-LG與PEG摩爾比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20)對修飾率的影響。

(4) 緩沖液中乙醇添加量：按1.2.1方法，TG酶與β-LG質(zhì)量比1∶1，β-LG與PEG摩爾比1∶10，反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)溫度25 ℃，考察緩沖液中乙醇添加量(0%，15%，25%，35%)(體積分?jǐn)?shù))對修飾率的影響。

(5) 反應(yīng)溫度：按1.2.1方法，TG酶與β-LG質(zhì)量比1∶1，β-LG與PEG摩爾比1∶10，反應(yīng)pH 7.0，緩沖液中乙醇添加量25%(體積分?jǐn)?shù))，考察反應(yīng)溫度(4，25，37 ℃)對修飾率的影響。

1.2.3 SDS-PAGE分析 參考Laemmli[16]的方法，用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行電泳。

1.2.4 凝膠過濾色譜分析 參考薛曉瑩[17]的方法，不同反應(yīng)條件下β-LG的PEG修飾產(chǎn)物的修飾率經(jīng)Superdex 200凝膠色譜柱進(jìn)行測定。按式(1)計算。

(1)

式中：

R——修飾產(chǎn)物的修飾率，%；

A1——β-LG的PEG修飾產(chǎn)物的峰面積，cm2；

A——總蛋白峰面積，cm2。

1.2.5β-LG的PEG修飾產(chǎn)物的純化 參考Yu等[18]的方法并稍作改動，用SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱對修飾產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。用pH 4.0，0.04 mol/L醋酸鈉初始緩沖液(洗脫液A)和含1.0 mol/L NaCl的0.04 mol/L，pH 4.0醋酸鈉緩沖液(洗脫液B)，以流速2 mL/min 進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0%～100%洗脫液B。在280 nm下測定各洗脫液的吸光值。收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE分析確定各洗脫峰的成分。然后收集PEG修飾產(chǎn)物的洗脫峰，用截留分子量10 kDa的Amicon Ultra-15超濾離心管于4 ℃下以4 990 r/min離心20 min，濃縮得到樣品。

1.2.6 反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析 參考李慧等[19]和玉瑩等[20]的方法，用Waters SunFire C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)對β-LG及其修飾產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.2.7 抗原性分析 參考蔡小飛等[1]和Kleber等[21]的方法，采用間接競爭ELISA法測定PEG修飾前后β-LG的抗原性?？乖越档吐拾词?2)計算[1]。

(2)

式中：

P——抗原性降低率，%；

Ai——待測樣品在490 nm處測得的吸光度；

A1——β-LG在490 nm處測得的吸光度；

A0——空白對照組在490 nm處測得的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用Origin 8.0軟件作圖。所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 TG酶與β-LG質(zhì)量比(E/S)及反應(yīng)pH值對修飾率的影響 由圖1(a)中泳道2～5可知，4種E/S下的反應(yīng)液在電泳圖中均只含有2個條帶，分別在18，28 kDa附近，β-LG標(biāo)準(zhǔn)品的條帶在18 kDa附近。因此，推測28 kDa 附近條帶為其PEG修飾產(chǎn)物。比較28 kDa附近條帶可知，隨著E/S的增大，PEG修飾產(chǎn)物的量逐漸增加。修飾率測定結(jié)果如圖1(b)所示，隨著E/S的增大，其修飾率逐漸增大，在E/S為3∶1時達(dá)到最大。由于E/S增大時反應(yīng)液中TG酶濃度增大，使酶與底物的接觸面積增大，從而使修飾率增大；當(dāng)E/S為3∶1時，酶濃度接近飽和，繼續(xù)增大E/S其修飾率不再明顯增加。

由圖1(a)中泳道7～10可知，隨著pH值的增大，PEG修飾產(chǎn)物的量呈先增大后減小的趨勢，且在pH 6.0，7.0時均較大。修飾率測定結(jié)果與電泳結(jié)果一致，如圖1(c) 所示，在pH 7.0時其修飾率最大，可能與TG酶的最適pH有關(guān)，在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)其反應(yīng)活性最強(qiáng)。

綜上可知，5 kDa mPEG-NH2定點修飾β-LG的最佳TG酶與β-LG質(zhì)量比為3∶1，最佳反應(yīng)pH為7.0。

2.1.2β-LG與PEG摩爾比及乙醇添加量對修飾率的影響 由圖2(a)、(b)可知，隨著PEG添加量的增加，其修飾率呈先增大后減小的趨勢，在β-LG與PEG摩爾比為1∶15 時最大。由于PEG添加量的增加使β-LG與PEG的接觸面積增大，有利于修飾反應(yīng)的進(jìn)行；而當(dāng)添加量過高時，反應(yīng)液中過多的PEG會阻礙β-LG與TG酶的接觸，從而使修飾率降低。

1. 蛋白Marker 2～5. 分別表示E/S為5∶1，3∶1，1∶1，1∶3時的反應(yīng)液 6.β-LG 7～10. 分別表示pH為5.0，6.0，7.0，8.0時的反應(yīng)液

圖1 E/S及反應(yīng)pH值對修飾率的影響

由圖2(a)、(c)可知，隨著乙醇添加量的增加，其修飾率呈先增大后減小的趨勢，在乙醇添加量為25%時最大；而當(dāng)乙醇添加量為35%時幾乎無PEG修飾產(chǎn)物生成，生成大量沉淀，說明當(dāng)乙醇添加量為35%時，緩沖液中乙醇濃度過高，使蛋白聚集沉淀，從而阻礙了反應(yīng)的進(jìn)行。

1. 蛋白Marker 2.β-LG 3～6. 分別表示β-LG與PEG摩爾比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20時的反應(yīng)液 7～10. 分別表示乙醇添加量(體積分?jǐn)?shù))為0%，15%，25%，35%時的反應(yīng)液

圖2 β-LG與PEG摩爾比及乙醇添加量對

Figure 2 Effects of molar ratio ofβ-LG to PEG and ethanol addition amount on modification rate

綜上可知，5 kDa mPEG-NH2定點修飾β-LG的最佳β-LG與PEG摩爾比為1∶15，最佳乙醇添加量為25%(體積分?jǐn)?shù))。

2.1.3 反應(yīng)溫度對修飾率的影響 由圖3(a)、(b)可知，反應(yīng)溫度對修飾反應(yīng)的影響較大，在3個溫度下PEG修飾產(chǎn)物的修飾率分別為14.08%，27.56%，4.36%，在25 ℃ 時其修飾率最高。因此，確定其最佳反應(yīng)溫度為25 ℃。

1. 蛋白Marker 2～4. 分別為4，25，37 ℃時的反應(yīng)液 5. β-LG

圖3 反應(yīng)溫度對修飾率的影響

綜上可知，PEG定點修飾β-LG的最優(yōu)條件為反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)溫度25 ℃，β-LG與PEG摩爾比1∶15，TG酶與β-LG質(zhì)量比3∶1，緩沖液中乙醇添加量25%(體積分?jǐn)?shù))，該修飾條件下其PEG修飾產(chǎn)物的修飾率為60.17%。

2.2 β-LG的PEG修飾產(chǎn)物的純化

如圖4所示，經(jīng)0.0～1.0 mol/L NaCl鹽離子梯度洗脫后，反應(yīng)混合液主要出現(xiàn)兩個洗脫峰F1和F2。PEG與蛋白結(jié)合后會屏蔽蛋白表面的電荷，從而使蛋白與層析介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度減弱，因此PEG修飾產(chǎn)物會先于未修飾的蛋白而被洗脫下來[22]。據(jù)此推測，洗脫峰F1，F(xiàn)2分別為β-LG的PEG修飾產(chǎn)物和未修飾的β-LG。

分別收集兩個洗脫峰經(jīng)SDS-PAGE分析，由圖5可知，洗脫峰F1在28 kDa左右有1個明顯的條帶，而洗脫峰F2在18 kDa左右有1個明顯的條帶，表明F1、F2兩個洗脫峰分別對應(yīng)β-LG的PEG修飾產(chǎn)物和未修飾的β-LG，與上述推測結(jié)果一致。此外，有研究[23]表明，在溶液中，PEG分子的每個乙氧基單元會與2～3個水分子結(jié)合，使PEG修飾產(chǎn)物的水化半徑明顯增大，因而PEG修飾產(chǎn)物的表觀分子量通常是未修飾蛋白的分子量與2～3倍的PEG實際分子量之和。在圖5中，β-LG的分子量在18 kDa左右，而其PEG修飾產(chǎn)物的分子量在28 kDa左右，剛好約為1個β-LG分子的分子量與2倍PEG分子量之和。據(jù)此推測，所得的產(chǎn)物為PEG單修飾產(chǎn)物，即1個PEG分子與1個β-LG分子結(jié)合。

圖4 β-LG的PEG修飾混合物的陽離子交換色譜圖

1. 蛋白Marker 2. 修飾混合物 3與5. 洗脫峰F1 4與6. 洗脫峰F2 7.β-LG

圖5 陽離子交換色譜純化得到的各洗脫峰SDS-PAGE圖

Figure 5 SDS-PAGE analysis of elution peaks obtained by purification

2.3 反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析

如圖6所示，經(jīng)乙腈和水梯度洗脫后，β-LG分別在31.3，32.7 min出現(xiàn)兩個洗脫峰。牛乳中β-LG主要存在A、B兩種遺傳變異體，有研究[20,24]表明，通過RP-HPLC可將兩種變異體分離開。因此，圖6中β-LG的兩個洗脫峰可能分別為其A、B兩種遺傳變異體。經(jīng)陽離子交換色譜純化得到的PEG修飾產(chǎn)物，其色譜峰無明顯變化，除兩種遺傳變異體的洗脫峰外，無其他洗脫峰出現(xiàn)，表明在該修飾條件下PEG修飾位點固定，得到的修飾產(chǎn)物均一，無其他位置異構(gòu)體生成。

圖6 β-LG及其PEG修飾產(chǎn)物的反相高效液相色譜圖

2.4 PEG修飾前后β-LG的抗原性變化

如圖7所示，經(jīng)PEG定點修飾后β-LG的抗原性顯著降低，其降低率約為59.04%。由于在PEG修飾過程中添加了25%乙醇，為了探究25%乙醇是否會對β-LG的抗原性產(chǎn)生影響，以經(jīng)25%乙醇處理過的β-LG為另一對照組對其抗原性進(jìn)行測定，結(jié)果表明25%乙醇對β-LG的抗原性影響不大，其抗原性降低率僅為10.67%。上述試驗結(jié)果表明，酶催化PEG定點修飾導(dǎo)致β-LG抗原性降低，其主要原因是連接在蛋白上的PEG鏈發(fā)揮了某種作用，而修飾條件對其抗原性影響不大。Mu等[25]研究表明，連接在蛋白上的PEG鏈能在蛋白表面形成一層獨特的水化層，因而造成對蛋白的空間屏蔽作用。有研究[26-27]表明，β-LG的抗原性與線性表位和構(gòu)象表位有關(guān)。肽段AA41～60，AA102～124，AA149～162是β-LG的主要抗原表位，分別能被92%，97%，89%的人血清識別[28]。因此，連接在β-LG分子上的大分子PEG鏈覆蓋在蛋白表面，可能會掩蓋表面的一些線性表位和構(gòu)象表位，阻礙其與特異性抗體的結(jié)合，因而使β-LG的抗原性顯著降低。

1. β-LG 2. 經(jīng)25%乙醇處理過的β-LG 3. PEG修飾產(chǎn)物

Figure 7 Effect of site specific PEGylation at β-lactoglobulin glutamine residues on antigenicity

3 結(jié)論

本研究運用酶催化PEG定點修飾技術(shù)對β-LG的Gln殘基進(jìn)行定點修飾，通過SDS-PAGE結(jié)合凝膠過濾色譜分析確定最佳修飾條件為反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)溫度25 ℃，β-LG與PEG摩爾比1∶15，TG酶與β-LG質(zhì)量比3∶1，緩沖液中乙醇添加量25%(體積分?jǐn)?shù))，在該修飾條件下其PEG修飾產(chǎn)物的修飾率為60.17%。最佳修飾條件下的修飾混合物經(jīng)陽離子交換色譜純化后，得到了均一的PEG單修飾產(chǎn)物。經(jīng)PEG修飾后β-LG的抗原性顯著降低，降低率可達(dá)59.04%。本試驗僅對酶催化PEG定點修飾前后β-LG的抗原性變化情況進(jìn)行了初步探究，后續(xù)可通過蛋白結(jié)構(gòu)分析及PEG修飾位點分析等手段對其抗原性變化機(jī)理進(jìn)行深入研究，為實現(xiàn)β-LG抗原性的有效調(diào)控打下基礎(chǔ)。此外，酶催化PEG定點修飾對β-LG 的功能特性如乳化性、起泡性、凝膠性等的影響也有待研究。