燈盞花素對慶大霉素所致急性腎損傷的保護作用及機制研究*

趙麗雅，胡宏英，任利彬

（邯鄲市中心醫(yī)院，邯鄲 056001）

急性腎損傷（AKI）是指腎功能短期內急劇下降而導致電解質紊亂、酸堿失衡的一種臨床危急重癥，具有多種誘發(fā)因素，臨床上各種腎毒性藥物及造影檢查、放化療等均是AKI的誘因[1]，其中慶大霉素連續(xù)治療7 d以上的患者并發(fā)AKI的發(fā)病率達20%左右[2-3]，極大地增加了治療風險，因此研究能夠有效抑制或緩解慶大霉素所致腎損傷的藥物具有重要的臨床意義。腎炎康復片具有健脾補腎、益氣養(yǎng)陰、利水消腫等功效，是臨床上治療腎臟相關疾病的常用中成藥制劑，也用于腎功能損傷新型藥物研究的陽性對照藥物[3]。燈盞花素（Bre）是中國傳統(tǒng)中藥燈盞花的主要活性成分，既往研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素對造影劑所致急性腎損傷[4]、順鉑所致急性腎損傷[5]均具有一定的保護作用，但燈盞花素是否對慶大霉素致AKI影響的文獻報道尚不多見，本實驗將對這一問題進行研究分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠（8周齡，230~250 g）購自河北省實驗動物中心（SCXK（冀）2013-1-003）。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗，飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫25℃、相對濕度60%，光照12 h∶12 h。

1.2 試驗藥物與試劑 燈盞花素片（廣州彼迪藥業(yè)有限公司，規(guī)格：20mg/片，批號：20170924）；腎炎康復片（天津同仁堂集團股份有限公司，規(guī)格：0.48 g/片，批號：170410）；硫酸慶大霉素注射液（河南潤弘制藥股份有限公司，規(guī)格：2 mL∶80 mg（8 萬單位），批號：20180203）。24 h 尿蛋白量（Pro）、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAG酶）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、巨噬細胞炎癥蛋白-2（MIP-2）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司（批 號 ：20171126、20171209、20170930、20171025、20170826、20171118、20171031）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：171022、180106、171219）；腎損傷分子-1（KIM-1）抗體購自碧云天生物技術有限公司（批號：201711016）。

1.3 實驗儀器 卓越310型全自動生化分析儀（武漢精誠偉業(yè)醫(yī)療設備有限公司）；FA25型勻漿機（上海洽姆儀器科技有限公司）；iMark型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；UV-1200紫外-可見光分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；CUT4062型石蠟切片機（德國SLEE公司）；BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)。

1.4 分組、造模與給藥 取120只實驗用清潔級Wistar大鼠按隨機數字表法，隨機分為正常對照組、模型對照組、腎炎康復片[800 mg/（kg·d），陽性藥對照組]、燈盞花素低[6 mg/（kg·d）]、中[12 mg/（kg·d）]、高[24 mg/（kg·d）]劑量組，每組均20只。造模方法[3，6]：造模前12 h禁食、自由飲水，除正常對照組，其余各組大鼠連續(xù)7 d腹腔注射給予慶大霉素（140 mg/kg·d）。藥物配制：精確稱量燈盞花素并加入適量生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液），配制濃度為12 mg/mL的燈盞花素溶液，并依次稀釋配制濃度為6、3 mg/mL的燈盞花素溶液；取適量腎炎康復片、研碎后加入適量生理鹽水以配制濃度為400 mg/mL的腎炎康復片溶液。各組均于造模第1天開始給藥，燈盞花素各劑量組和腎炎康復片組分別取適當濃度藥液、以2 mL/（kg·d）劑量灌胃給藥，正常對照組和模型對照組分別以2 mL/（kg·d）劑量給予生理鹽水；療程均為14 d。

1.5 標本采集 治療完成后，收集各大鼠24 h尿液，-20℃凍存待檢；麻醉后經腹主動脈取血（不抗凝），4℃低溫靜置1 h后離心（轉速：1 500 r/min，時間：10 min）取血清，-20℃凍存待檢；取兩側腎臟組織，生理鹽水沖洗表面血液并用濾紙擦拭干凈后，-80℃凍存待檢。

1.6 指標檢測 測定24 h排尿量、生化分析法測定Pro、比色法測定尿NAG酶活性；苦味酸比色法測定血Scr含量，二乙酰肟法測定BUN含量；稱量體質量和兩側腎臟質量，計算腎臟指數，腎臟指數=兩側腎臟質量/體質量。取左側腎臟，于4%多聚甲醛-生理鹽水溶液固定72 h后依次進行石蠟包埋、切片處理，通過免疫組織化學（IHC）染色檢測腎臟組織KIM-1蛋白表達，采用Image Pro plus圖像分析系統(tǒng)測定切片平均光密度值（OD值）；通過HE染色進行病理學檢查并行損傷評分[7]：1）腎小球病變評分：結構正常為0分，少數變大或縮小為1分，部分變大或縮小為2分，大多數變大或縮小為3分（出現(xiàn)玻璃樣變也為3分）。2）腎小管病變評分：結構正常為0分，根據近曲小管細胞出現(xiàn)空泡變性數量，少量為1分、中量為2分、大量為3分。3）腎間質病變評分：結構正常為0分，根據腎小管萎縮程度，輕度為1分、中度為2分、重度為3分。4）炎性病變評分：結構正常為0分，小灶狀炎癥病變?yōu)?分，片狀炎細胞浸潤且個別腎小管壞死為2分，大片炎細胞浸潤且少量腎組織壞死為3分；病變積分=∑各部位病變評分。取右側腎臟，加入適量預冷（4℃）生理鹽水、在4℃環(huán)境中進行研磨勻漿，制備濃度為10%的組織勻漿液，4℃離心（轉速：3 000 r/min，時間：10 min）取上清液，采用TBA法測定MDA含量、羥胺法測定SOD活性、比色法測定CAT活性，采用酶聯(lián)免疫吸附法通過酶標儀測定臟組織MIP-2、MCP-1、TNF-α 含量。

1.7 統(tǒng)計學處理 運用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行數理分析，計量資料以均數±標準差（x±s）方式表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠排尿量、24 h Pro、尿NAG酶活性和血BUN、Scr含量測定 與正常對照組相比，模型對照組大鼠排尿量、24 h Pro、尿NAG酶活性和血BUN、Scr含量均顯著升高（P<0.01）；與模型對照組比較，發(fā)現(xiàn)經燈盞花素中、高劑量或腎炎康復片治療14 d能夠顯著降低慶大霉素致AKI大鼠排尿量、24 h Pro、NAG酶活性并降低血BUN、Scr含量（P<0.05或P<0.01）；AKI高劑量組與腎炎康復片比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 各組大鼠體質量、腎臟重量和腎臟指數測定 與正常對照組相比，模型對照組大鼠體質量顯著降低、腎臟質量和腎臟指數顯著升高（P<0.01）；與模型對照組相比，發(fā)現(xiàn)經燈盞花素中、高劑量或腎炎康復片治療14 d能夠顯著降低慶大霉素致AKI大鼠腎臟質量和腎臟指數（P<0.05或P<0.01），燈盞花素高劑量組體質量顯著降低（P<0.05）；與腎炎康復片組相比，燈盞花素高劑量組大鼠腎臟指數顯著降低（P<0.05），見表 2。

2.3 各組大鼠腎臟組織KIM-1蛋白表達測定 與正常對照組相比，模型對照組大鼠腎臟組織KIM-1蛋白表達明顯上調、OD值顯著升高（P<0.01）；而與模型對照組相比，燈盞花素各劑量組和腎炎康復片組大鼠腎臟組織KIM-1蛋白表達均呈不同程度下調，其中燈盞花素中、高劑量組OD值顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與腎炎康復片組比較，燈盞花素高劑量組OD值顯著降低（P<0.05），見圖1、表3。

表1 各組大鼠排尿量、24 h Pro、尿NAG酶活性和血BUN、Scr含量測定結果（x±s）Tab.1 Urine volume，Pro，the activity of NAG and the content of blood BUN，Scr of rats in each group（x±s）

表2 各組大鼠體質量、腎臟質量和腎臟指數測定結果（x±s）Tab.2 Body weight，kidney weight and kidney index of rats in each group（x±s）

圖1 各組大鼠腎臟組織KIM-1蛋白表達測定結果（IHC，×400）Fig.1 Expression of KIM-1 protein in renal tissue of rats in each group（IHC，×400）

表3 各組大鼠腎臟組織KIM-1蛋白表達OD值和損傷評分測定結果（x±s）Tab.3 OD value of KIM-1 protein expression and renal tissue damage score of rats in each group（x±s）

2.4 各組大鼠腎臟組織病理學檢查 空白對照組大鼠腎小球、腎小管結構及細胞形態(tài)均未見異常；較正常對照組，模型對照組大鼠腎臟組織呈現(xiàn)明顯的病理性改變，表現(xiàn)為腎小球數量減少、囊腔比例增大，腎小管出現(xiàn)結構異常、細胞壞死，間質呈纖維化病變，大量炎性細胞浸潤等；較模型對照組，燈盞花素各劑量組和腎炎康復片組大鼠腎臟組織上述病理性改變呈不同程度改善，其中以燈盞花素高劑量組效果最為顯著，見圖2。對各組病理切片進行損傷評分：與正常對照組比較，慶大霉素所致AKI大鼠腎臟組織評分顯著升高（P<0.01）；與模型對照組比較發(fā)現(xiàn)，經燈盞花素中、高劑量或腎炎康復片治療14 d能夠顯著降低慶大霉素致AKI大鼠腎臟組織損傷評分（P<0.05或P<0.01）；與腎炎康復片組比較，燈盞花素高劑量組大鼠腎臟組織評分顯著降低（P<0.05），結果見表 3。

2.5 各組大鼠腎臟組織SOD、CAT活性和MDA含量測定 與正常對照組相比，模型對照組大鼠腎臟組織SOD、CAT活性顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.01）；而與模型對照組相比，發(fā)現(xiàn)經燈盞花素中、高劑量或腎炎康復片治療14 d能夠顯著提高SOD、CAT活性并降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）；腎炎康復片組MDA含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與腎炎康復片組比較，燈盞花素高劑量組大鼠CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P<0.05），見表 4。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學檢查結果（HE，×400）Fig.2 Pathological changes of renal tissue of rats in each group（HE，×400）

表4 各組大鼠腎臟組織SOD、CAT活性和MDA含量測定結果（x±s）Tab.4 Activity of SOD，CAT and the content of MDA in renal tissue of rats in each group（x±s）

2.6 各組大鼠腎臟組織MIP-2、MCP-1、TNF-α含量測定 如表5所示，與正常對照組相比，模型對照組大鼠腎臟組織MIP-2、MCP-1、TNF-α含量均顯著升高（P<0.01）；而與模型對照組相比，發(fā)現(xiàn)經燈盞花素中、高劑量或腎炎康復片治療14 d能夠顯著降低慶大霉素致AKI大鼠MIP-2、MCP-1、TNF-α含量（P<0.05或P<0.01）；燈盞花素高劑量組與腎炎康復片比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

慶大霉素是氨基糖苷類抗菌藥物的代表性藥物，其對革蘭陰性菌、腸球菌等感染療效顯著而廣泛應用于臨床，但慶大霉素容易引發(fā)腎功能損傷，有研究報道慶大霉素連續(xù)治療7 d以上的患者并發(fā)AKI的發(fā)病率達20%左右[2]，引起醫(yī)藥工作者的普遍關注。而慶大霉素所致AKI主要表現(xiàn)為BUN、Scr升高[8]。

燈盞花素是一種具有多種生物學活性的黃酮類化合物，是中國傳統(tǒng)中藥燈盞花的主要活性成分。本研究采用連續(xù)7 d腹腔注射給予慶大霉素[140 mg/（kg·d）]的方法制備慶大霉素致AKI大鼠模型，于造模第1天開始給予燈盞花素進行干預，實驗結果顯示，經燈盞花素干預14 d能夠有效降低慶大霉素致AKI大鼠排尿量、24 h Pro水平，降低血BUN、SCr水平，抑制腎水腫、降低腎臟指數，抑制腎組織損傷、降低損傷評分，抑制腎小球、腎小管細胞超微結構病變，并且燈盞花素高劑量組對腎臟指數的改善及對腎組織損傷的抑制作用優(yōu)于腎炎康復片組，提示燈盞花素具有抑制慶大霉素致AKI大鼠腎組織損傷、改善其腎功能的藥理學作用。

表5 各組大鼠腎臟組織MIP-2、MCP-1、TNF-α含量測定結果（x±s）Tab.5 Content of MIP-2，MCP-1，TNF-α in renal tissue of rats in each group（x±s） μmol/g

NAG酶是一種廣泛存在于各組織器官溶酶體中的特異性小管酶，腎小管上皮細胞含量豐富，其分子量較大（130 000~140 000道爾頓），生理狀態(tài)下不能通過腎小球膜，只有當膜通透性遭到破壞的病理狀態(tài)下才能釋放到尿液中，因此尿NAG酶活性水平能夠間接反映腎小管損傷程度。KIM-1是評價腎小管損傷的重要標志物，本實驗研究結果顯示，慶大霉素致AKI大鼠尿NAG酶活性升高、腎組織KIM-1表達上調，而經燈盞花素治療14 d能夠顯著降低尿NAG酶活性并下調KIM-1蛋白表達，并且燈盞花素高劑量組對KIM-1蛋白表達的影響優(yōu)于腎炎康復片組，說明燈盞花素具有抑制慶大霉素致AKI大鼠腎組織損傷的作用。

慶大霉素導致AKI的作用機制比較復雜，目前尚無定論，其中氧化應激損傷和炎癥反應已經得到廣大研究者的普遍認可[9]，而燈盞花素具有顯著的抗氧化作用[10]。體內氧自由基代謝失衡而多度蓄積是導致機體氧化應激損傷的根本機制，而腎組織抗氧化酶（SOD、CAT）活性降低是導致氧自由基代謝能力下降的主要原因[11]；Kinsey GR等[12]研究報道急性腎衰竭將導致腎小管上皮細胞釋放TNF-α、MCP-1、MIP-2等炎癥因子而導致炎癥細胞的趨化與活化，進行引發(fā)炎癥反應。本實驗研究結果顯示，經燈盞花素治療14 d能夠顯著提高慶大霉素致AKI大鼠腎組織SOD、CAT活性并降低MDA含量，降低炎癥因子TNF-α、MCP-1、MIP-2水平，燈盞花素高劑量組對抗氧化酶活性和炎癥細胞因子表達的影響優(yōu)于腎炎康復片組，提示燈盞花素具有抑制慶大霉素致AKI大鼠氧化應激損傷和炎癥反應的作用。

綜上所述，燈盞花素對慶大霉素致AKI大鼠腎組織急性損傷具有一定的保護作用，其作用機理可能與燈盞花素能夠改善腎功能、抗氧化、抑制炎癥有關。