伸筋易骨法調(diào)控軟骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度干預(yù)細(xì)胞代謝的機(jī)制研究*

馬銘華，王一洲，趙 強(qiáng)

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是臨床最常見的退行性骨關(guān)節(jié)疾病，初期以關(guān)節(jié)滑膜病變?yōu)橹?，隨著滑膜內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)和關(guān)節(jié)應(yīng)力重構(gòu)的不斷發(fā)生，細(xì)胞外基質(zhì)被破壞，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞的生長環(huán)境[1]。軟骨組織是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的一種致密結(jié)締組織，軟骨基質(zhì)內(nèi)包含有大量的Ⅱ型膠原纖維和蛋白多糖，這兩種生物分子使軟骨組織具備足夠的粘彈性，同時也形成了軟骨細(xì)胞特殊的代謝環(huán)境[2]。體內(nèi)環(huán)境下，軟骨細(xì)胞的增殖分化非常緩慢，軟骨細(xì)胞通過細(xì)胞膜表面的離子通道和框架蛋白響應(yīng)關(guān)節(jié)內(nèi)微應(yīng)力環(huán)境調(diào)控細(xì)胞分泌基質(zhì)的功能[3]，而鈣離子（Ca2+）作為第二信使是連接細(xì)胞內(nèi)外的重要信息素。前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，軟骨細(xì)胞內(nèi)L型、P/Q型電壓依賴性鈣通道蛋白亞單位Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、Cav2.1的表達(dá)受應(yīng)力環(huán)境調(diào)控。本研究通過激光共聚焦顯微鏡和膜片鉗技術(shù)繼續(xù)深入挖掘推拿手法調(diào)控L型電壓依賴性鈣通道影響軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)細(xì)胞合成代謝的機(jī)制，為此類物理治療發(fā)揮作用的可能機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑 DMEM（Hyclone公司，美國）；TRYPSIN 0.25%EDTA、雙抗（Gibco公司，美國）；FBS（ExCell公司，中國）Ⅱ型膠原酶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷、Trypsin（Sigma公司，美國）；CsCl（Amresco公司，美國）；L-Aspartic acid potassium salt、EGTA（Fluka Biochemika公司，美國）；Ca2+探針（索萊寶公司，中國）。

1.2 儀器設(shè)備 BZY-DG007型鼠兔跑臺（東莞博之遠(yuǎn)生物科技發(fā)展有限公司，中國）；BY-80C型醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械公司，中國）；PC-100型微電極拉制器（Narishige公司，日本）；低溫離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）MC1000e三維手動微操縱器（SD公司，美國）Digidata 1322A型AID-DIA轉(zhuǎn)換器（Axon公司，美國）；pCLAMP 9.0軟件（Sigma公司，美國）。

1.3 分組及處理 （6.23±0.51）月齡雌性日本大耳白兔 50只[SYXK（京）2014-0003]，平均體質(zhì)量（3.17±0.31）kg，運用改良的 Hulth 造模法[5]模擬應(yīng)力失常誘導(dǎo)的KOA，編號并隨機(jī)均分為5組，造模成功后，治療組以伸筋易骨法治療，對照組以關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液治療，假手術(shù)組在脛骨內(nèi)側(cè)髁內(nèi)上打開2 cm左右創(chuàng)口，鈍性分離直至暴露關(guān)節(jié)腔后，不做處理，閉合關(guān)節(jié)腔，并逐層縫合，假手術(shù)組、模型組造模成功后與空白組及其他各組同條件飼養(yǎng)，治療結(jié)束后取材，機(jī)械-酶法分離軟骨細(xì)胞[6]。

1.4 治療方法 治療方法如下[7]：1）應(yīng)用自制固定器將兔仰臥位固定，指揉法作用于足陽明胃經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)各約5 min。2）以點按法作用于血海、梁丘、犢鼻、足三里、陽陵泉、委中、承山穴，每穴1 min。3）以指推法從髂前上棘自上而下推至髕骨上緣，操作9遍。4）屈髖屈膝90°，以搖法順時針操作9遍；將髖關(guān)節(jié)外展至極限，行膝關(guān)節(jié)拔伸法，直至膝關(guān)節(jié)伸直，操作9遍。4）沿膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)從前至后行擦法1 min，結(jié)束手法。上述手法1次/日，共治療21 d。對照組治療方法如下：1）應(yīng)用自制固定器將兔仰臥位固定，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒備皮。2）髕旁入路，造模側(cè)膝關(guān)節(jié)注入玻璃酸鈉注射液1 mL。3）屈伸膝關(guān)節(jié)數(shù)次以使藥液充分覆蓋關(guān)節(jié)，紗布蒙蓋注射區(qū)。上述治療每周1次，共治療3周。

1.5 激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞Ca2+濃度 將分離的原代軟骨細(xì)胞放入培養(yǎng)孔，預(yù)置細(xì)胞爬片，待第2天鏡下觀察細(xì)胞部分貼壁后進(jìn)行以下操作：1）向Fluo-4，AM/DMSO溶液中加入16.5 mg Pluronic F127（Pluronic F127可以防止Fluo-4，AM在HBSS中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞）。2）用HBSS稀釋Fluo-4，AM溶液，制備 4μmol/L的 Fluo-4，AM 工作液。3）吸出培養(yǎng)基至剩余約50μL，加入約1 mL PBS，清洗細(xì)胞孔。剩余約50μL磷酸鹽緩沖液（PBS），再次加入1 mL PBS清洗。4）盡量移去上清，迅速將Fluo-4，AM工作液加入培養(yǎng)孔（約100μL），在37℃培養(yǎng)30 min。5）加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS中和，再繼續(xù)培養(yǎng)40 min。6）用HBSS洗滌3次。7）37℃下培養(yǎng)10 min，制作臨時裝片，然后用顯微鏡進(jìn)行熒光Ca2+檢測。激發(fā)波長494 nm，發(fā)射波長516 nm。

1.6 軟骨細(xì)胞電生理檢測 將分離好的原代軟骨細(xì)胞懸浮于配置好的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液底部放置5片載玻片，培養(yǎng)箱中靜置預(yù)爬片，取出載玻片，鏡下選取貼壁良好、形態(tài)正常的軟骨細(xì)胞進(jìn)行檢測。通過pClampex9.2軟件進(jìn)行軟骨細(xì)胞離子通道電流的采集。將拉置好的微電極灌入預(yù)調(diào)PH為7.2的電極液（CsCl 125 mmol/L、TEA-Cl 10 mmol/L、MgCl21 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、Mg-ATP 5 mmol/L、HEPES 5 mmol/L）并連接在顯微鏡的探頭上，此時電阻在2-4 MΩ之間。將負(fù)載目標(biāo)細(xì)胞的載玻片置于事先配置好的細(xì)胞外液中（N-methyl-D-glucamine 140 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、glucose 10 mmol/L），下降電極進(jìn)入液面并在與細(xì)胞接觸前補(bǔ)償尖端電位。形成高阻封接（>1 GΩ）后，負(fù)壓抽吸破膜，形成全細(xì)胞構(gòu)型，在電壓鉗模式下進(jìn)行刺激和記錄。鈣電流（ICa）的記錄：鉗制電位從-40 mV以10 mV為階躍至70 mV，測定200 ms的電流穩(wěn)態(tài)值；實驗過程由計算機(jī)軟件pClamp9.2（Axon Instrument）控制數(shù)-模轉(zhuǎn)換器完成采集和分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)輸入SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強(qiáng)度比較見圖1、表1。由圖1可見，激光共聚焦熒光Ca2+檢測中細(xì)胞內(nèi)Ca2+呈綠色熒光染色，模型組與空白組、假手術(shù)組相比熒光強(qiáng)度較暗，治療組和對照組熒光強(qiáng)度較模型組略強(qiáng)，但較空白組和假手術(shù)組稍暗。表1可知，模型組與空白組的Ca2+平均熒光強(qiáng)度值，有顯著性差異（P＜0.05），對照組與模型組的Ca2+平均熒光強(qiáng)度值比較有顯著性差異（P＜0.05），治療組與模型組的Ca2+平均熒光強(qiáng)度值比較具有顯著性差異（P＜0.05），對照組與治療組的Ca2+平均熒光強(qiáng)度值比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示膝關(guān)節(jié)應(yīng)力失常會影響原代軟骨細(xì)胞Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運，減少細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，伸筋易骨法和玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射可促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，增加軟骨細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度。

各組軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流密度見圖2、表2。各組軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流由膜片鉗檢測形成不同電流密度的軌跡圖，由圖2可見，模型組與空白組、假手術(shù)組相比電流密度較低，治療組和對照組電流密度較模型組高，但較空白組和假手術(shù)組低。由表2可知，模型組與空白組軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流密度有顯著性差異（P＜0.05），對照組與模型組軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流密度有顯著性差異（P＜0.05），治療組與模型組軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流密度有顯著性差異（P＜0.05），對照組與治療組軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流密度無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示膝關(guān)節(jié)應(yīng)力失常會抑制軟骨細(xì)胞L型鈣通道的活性，降低Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞的合成代謝，伸筋易骨法和玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射能夠通過活化L型鈣通道，提高軟骨細(xì)胞膜對Ca2+通透性，增加軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，啟動Ca2+依賴的合成代謝相關(guān)蛋白，改善關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分泌功能，調(diào)節(jié)軟骨和細(xì)胞外基質(zhì)的應(yīng)力重構(gòu)。

圖1 各組軟骨細(xì)胞染色強(qiáng)度（激光共聚焦顯微鏡，免疫熒光染色，×200、×400）Fig.1 Staining intensity of chondrocytes in each group（laser confocal microscopy，immunofluorescence staining，×200，×400）

3 結(jié)論

關(guān)節(jié)應(yīng)力失常會抑制軟骨細(xì)胞L型鈣通道的活性，降低Ca2+內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)鈣耗竭，影響軟骨細(xì)胞分泌和合成代謝[8]。伸筋易骨法和玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射均能夠活化L型鈣通道，提高軟骨細(xì)胞膜對Ca2+通透性，增加軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，推測伸筋易骨法通過調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)周圍軟組織性能，降低細(xì)胞表面應(yīng)力集中，軟骨外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)形態(tài)改變將力學(xué)信號傳導(dǎo)至細(xì)胞表面，并影響軟骨細(xì)胞周圍陽離子濃度，提高軟骨細(xì)胞膜的靜息膜電位[9]，活化軟骨細(xì)胞表面L型鈣通道。伸筋易骨法調(diào)節(jié)下肢整體應(yīng)力，改善關(guān)節(jié)微應(yīng)力環(huán)境，從遠(yuǎn)期療效考慮其效果優(yōu)于玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射。

表1 各組軟骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+平均熒光強(qiáng)度比較（x±s）Tab.1 Comparison of average fluorescence intensity of Ca2+in chondrocytes of each group（x±s）

圖2 兔軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流軌跡圖（-40-50 mV）Fig.2 Current trajectory of L-type calcium channel in rabbit chondrocytes（-40-50 mV）

表2 各組軟骨細(xì)胞L型鈣通道電流密度（x±s）Tab.2 Current Density of L-type Calcium Channel in Chondrocyte of each group（x±s）

3 討論

KOA的病因目前尚未明確，但關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和性能改變是KOA發(fā)生、發(fā)展和關(guān)節(jié)應(yīng)力重構(gòu)中最重要的一環(huán)。有研究表明[10]，應(yīng)力的強(qiáng)度、頻率、載荷方式均會影響軟骨細(xì)胞的生理功能，提升關(guān)節(jié)周圍肌肉、韌帶、滑膜等軟組織的力學(xué)性能，成為保護(hù)軟骨組織的重要途徑。

伸筋易骨法是趙強(qiáng)主任以筋骨并重為手法核心創(chuàng)制的一套KOA手法操作方案，伸筋易骨法重點選用足陽明胃經(jīng)、足太陰脾經(jīng)及兩經(jīng)穴點進(jìn)行手法刺激，達(dá)到健脾益胃、化食為能的作用，脾氣充盛，則能筋伸骨正。手法操作通過揉、等手法作用于股直肌、股二頭肌等淺部肌群，通過點、按法作用于腱-骨結(jié)合部以刺激深部肌群，同時彈撥肌腹增加筋膜間血液的流速，運用搖法、拔伸法等運動關(guān)節(jié)類手法刺激滑膜、韌帶。整套手法以膝關(guān)節(jié)周圍軟組織作為作用靶點，以恢復(fù)關(guān)節(jié)應(yīng)力環(huán)境為目的，發(fā)揮調(diào)筋治骨的作用。

近年來，筆者通過動物實驗逐步挖掘該手法的作用特點和內(nèi)涵，綜合前期研究筆者認(rèn)為，伸筋易骨法通過調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)周圍軟組織性能，改善關(guān)節(jié)微應(yīng)力環(huán)境，調(diào)控軟骨細(xì)胞表面離子通道，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，激活下游合成代謝相關(guān)蛋白，緩解KOA患者軟骨組織的損傷。未來筆者將更進(jìn)一步對推拿手法等物理治療的力學(xué)-生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行挖掘，為退行性骨關(guān)節(jié)病的防治研究作出貢獻(xiàn)。