PEP-1-SOD1對(duì)SAP大鼠細(xì)胞凋亡的影響*

呂 飛 田書芳

湖北省十堰市人民醫(yī)院消化內(nèi)科1(442000) 中醫(yī)科2

重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是以胰腺?gòu)浡猿鲅徒M織壞死為特征，由多種病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活后累及全身多個(gè)臟器的危重疾病，病死率一般>10%[1-2]。SAP的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種因素有關(guān)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨大量炎性介質(zhì)的釋放，其炎癥程度與腺泡細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)。超氧化物歧化酶(SOD)是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，清除自由基和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡是SAP的有效治療靶點(diǎn)之一。PEP-1-SOD1是一種利用基因工程技術(shù)合成的融合蛋白，具有高度的穩(wěn)定性，能攜帶多種肽段和蛋白質(zhì)以天然活性形式進(jìn)入細(xì)胞，該過程無(wú)需任何化學(xué)共價(jià)結(jié)合或變性步驟，具有較好的安全性[3]。有研究證實(shí)PEP-1-SOD1可轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入缺血/再灌注損傷后大鼠的大腦皮質(zhì)并發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[4]，但對(duì)SAP的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過觀察PEP-1-SOD1對(duì)SAP大鼠細(xì)胞凋亡的影響，旨在為探討PEP-1-SOD1的作用機(jī)制提供參考。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑

24只雄性Wistar大鼠購(gòu)自北京聯(lián)通利華生物技術(shù)有限公司[許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0001]，體質(zhì)量22～24 g，10周齡。血清淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司，caspase-3單克隆抗體和內(nèi)參β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司(工作濃度1∶500)，二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(工作濃度1∶2 500)。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。?；悄懰徕c購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

二、研究方法

1. 動(dòng)物分組、模型建立和處理：將所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、SAP組和實(shí)驗(yàn)組，每組各8只。SAP動(dòng)物模型的建立參照郭婉薇等[2]的方法。使用一次性靜脈留置套管針對(duì)系膜緣的腸壁進(jìn)行穿刺，逆行插入膽胰管，阻斷膽總管后，勻速注射5%?；悄懰徕c(1 mL/kg)，注射速率為0.1 mL/min。注射完畢5 min后拔管，回納十二指腸后關(guān)腹。實(shí)驗(yàn)組在造模前30 min腹部皮下注射8.0 mg/kg PEP-1-SOD1(美國(guó)BD公司)。SAP組大鼠注射同劑量的0.9% NaCl溶液。對(duì)照組常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

將所有大鼠麻醉后心臟采血，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，-20 ℃凍存?zhèn)錅y(cè)。取血后處死大鼠，取病變較為一致的胰頭部組織，置于4%甲醛溶液中固定，4 μm厚連續(xù)切片，行后續(xù)檢測(cè)。

2. TUNEL法檢測(cè)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡：選擇三組大鼠病理切片，二甲苯脫蠟后，加入TUNEL反應(yīng)液與轉(zhuǎn)化劑-POD，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)。

3. 血清脂肪酶、淀粉酶的測(cè)定：術(shù)后24 h，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清脂肪酶、淀粉酶水平。

4. 胰腺組織病理學(xué)評(píng)分：胰腺組織標(biāo)本行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下由病理科醫(yī)師行雙盲評(píng)分。0分：胰腺組織清晰，無(wú)炎癥；2分：胰腺炎癥區(qū)域所占比例≤5%；4分：6%～25%；6分：26%～50%；8分：51%～75%；10分：>75%。

5. 熒光定量PCR法檢測(cè)caspase-3 mRNA表達(dá)：采用Trizol一步法提取胰腺組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行熒光定量PCR。擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游：5’-CGG GTG TCA GGA ATC AAA TC-3’，下游：5’-TGG AAG GTC TCG CAA ATA CTG-3’，片段長(zhǎng)度275 bp。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。采用2-ΔΔCt法檢測(cè)caspase-3 mRNA表達(dá)水平。

6. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá)：具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。以β-actin作為內(nèi)參，蛋白表達(dá)量=各處理組蛋白條帶的光密度值/內(nèi)參蛋白條帶的光密度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、脂肪酶、淀粉酶水平比較

造模后24 h，SAP組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶水平較對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組顯著低于SAP組(P<0.05)(表1)。

二、組織病理學(xué)評(píng)分比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺小葉間隙增寬，可見中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，但小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完好；SAP組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，小葉排列紊亂，局部血管壁出血、壞死；對(duì)照組未見明顯異常(圖1)。

表1 三組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶水平比較

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

A：對(duì)照組；B：SAP組；C：實(shí)驗(yàn)組

造模后6 h、24 h，SAP組和實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組顯著低于SAP組(P<0.05)(表2)。

三、細(xì)胞凋亡情況

造模后6 h、24 h，實(shí)驗(yàn)組和SAP組胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組顯著高于SAP組(P<0.05)(表3)。

四、caspase-3表達(dá)情況

造模后24 h，實(shí)驗(yàn)組和SAP組胰腺組織caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組顯著高于SAP組(P<0.05)(表4、圖2)。

表2 三組大鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分比較

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

表3 三組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

表4 三組大鼠胰腺組織caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)比較

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與SAP組比較，P<0.05

1 Da=0.992 1 u

SAP是常見急腹癥之一，具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究認(rèn)為，發(fā)生SAP時(shí)，在損傷因子作用下，單核細(xì)胞被激活并釋放多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重情況下患者可出現(xiàn)多器官功能不全甚至死亡[5-6]。SAP的診治已成為目前的研究熱點(diǎn)。PEP-1是人工合成的細(xì)胞穿透肽，包含一個(gè)三肽SQP組成的連接序列、一個(gè)富含賴氨酸的親水性序列(KKKRKV)和一個(gè)富含色氨酸的疏水性序列(KETWWETWWTEW)。PEP-1可介導(dǎo)細(xì)菌胞外酶、過氧化氫酶、綠色熒光蛋白、核糖體蛋白以天然活性形式轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入離體或在體的細(xì)胞中，從而有效發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7]。SOD1主要存在于真核細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，可有效清除氧自由基，使細(xì)胞免受氧化損傷。有研究表明PEP-1與SOD1融合后，可使后者的半衰期延長(zhǎng)，穩(wěn)定性提高[8]。本研究顯示造模后24 h，SAP組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶水平較對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組顯著低于SAP組(P<0.05)；造模后6 h、24 h，SAP組和實(shí)驗(yàn)組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組顯著低于SAP組(P<0.05)。說明PEP-1-SOD1能緩解SAP病情，減輕大鼠胰腺組織的病理?yè)p害。

細(xì)胞凋亡是受眾多凋亡相關(guān)基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡可保護(hù)腺泡細(xì)胞損傷，并可減輕SAP病情[9]。腺泡細(xì)胞死亡是SAP炎癥過程中的重要病理特征，腺泡細(xì)胞的壞死和凋亡共同存在于SAP的不同病理類型中[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后6 h、24 h，實(shí)驗(yàn)組胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組和SAP組(P<0.05)。誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡可能在一定程度上減輕SAP的病情[11]。PEP-1-SOD1作為有機(jī)體重要的氧自由基清除劑，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而有利于保護(hù)胰腺組織的功能。有研究[4]表明PEP-1-SOD1預(yù)處理可使SOD1活性維持在較高水平，從而提高清除氧自由基的能力，從另一方面反映了其對(duì)胰腺組織的保護(hù)效應(yīng)。

現(xiàn)有研究表明，在SAP起病初期，如胰腺腺泡細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，可觸發(fā)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的預(yù)后[12]。細(xì)胞內(nèi)存在多條細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，caspases是細(xì)胞凋亡過程的主要執(zhí)行者，活化的caspase-3可經(jīng)蛋白酶解過程激活后，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。Caspase-3介導(dǎo)了急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡，caspase-3表達(dá)缺失可明顯加重大鼠SAP病情[14]。本研究中，造模后24 h，SAP組大鼠胰腺組織caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，但顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。表明PEP-1-SOD1能調(diào)節(jié)caspase-3表達(dá)水平，從而影響胰腺細(xì)胞的凋亡。

總之，PEP-1-SOD1可通過調(diào)控SAP大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)，減輕胰腺組織病理?yè)p害，增加胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰腺功能恢復(fù)正常。但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。