CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中的發(fā)展和利用

沈明晨 薛超 喬中英 龔志云

摘要：基因組學的快速發(fā)展和多種基因組編輯技術的出現(xiàn)，對植物科學以及農(nóng)業(yè)領域中的基因功能研究和遺傳改良產(chǎn)生了巨大影響。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因組編輯技術能夠快速編輯各種生物體中的基因組，以其簡單穩(wěn)定高效等優(yōu)點，成為目前最先進且被廣泛運用的系統(tǒng)。水稻是我國最重要的糧食作物之一，其遺傳資源豐富且基因組小，適合用于基因組編輯技術的研究。討論水稻改良的基因組編輯策略，重點介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻抗病性、抗逆性、雜種優(yōu)勢等方面的應用和進展，強調(diào)CRISPR/Cas9在水稻改良中的主要挑戰(zhàn)和發(fā)展意義。

關鍵詞：水稻;CRISPR/Cas9;基因組編輯;作物改良

中圖分類號： S511.01? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0005-06

水稻在不同環(huán)境條件下適應性較強，因此被世界糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）視為全球糧食安全的戰(zhàn)略作物[1]。據(jù)統(tǒng)計到2050年，全球大米消費量將增加到6.5億t，而要滿足日益增長的人口對糧食的需求，還需要多生產(chǎn)40%的大米[2]。在過去的幾十年里，傳統(tǒng)的分子育種方法極大地促進了水稻產(chǎn)量的提高。然而，近幾十年來水稻產(chǎn)量卻逐漸下降。當前農(nóng)業(yè)面臨著人口快速增長、全球氣候變化、病蟲害以及其他環(huán)境危害等多重挑戰(zhàn)。因此，迫切需要高產(chǎn)潛力、高非生物脅迫耐受性以及抗主要病蟲害病原菌的水稻新品種。

近年來，基因組編輯技術的出現(xiàn)打破了傳統(tǒng)育種方法的局限性，開創(chuàng)了作物改良的新時代?；蚪M編輯主要是對序列特異核酸酶（SSNs）位點進行編輯從而修飾基因組中特定位置的特定基因。目前，SSNs包括鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）和規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關核酸酶9（CRISPR/Cas9）[3]。其中，CRISPR/Cas9是植物生物學中最先進的基因組編輯工具[4-5]。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

有機體通過適應性免疫保護自己免受病毒的感染，并通過DNA修復機制維護自己基因組的完整性[1，6]。例如，在細菌和古生菌中，CRISPR系統(tǒng)是一種針對病毒感染和質(zhì)粒結(jié)合的自然適應性免疫系統(tǒng)，能夠使特定的微生物對外來遺傳物質(zhì)做出反應并消除它們[1，7-10]。微生物通過轉(zhuǎn)導、結(jié)合、轉(zhuǎn)化接觸外來遺傳物質(zhì)，將外來DNA的短片段整合到CRISPR區(qū)域建立防御系統(tǒng)，從而保護自身免受基因組入侵[10-11]。CRISPR區(qū)域包含短的重復堿基序列，被稱為間隔序列，其與噬菌體或質(zhì)粒等外來元素具有序列同源性[6]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型這3種類型。Ⅱ型系統(tǒng)是目前最成功的人工核酸酶，并且被廣泛應用于基因組編輯[12]。在Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)中，單一的與CRISPR相關的核酸內(nèi)切酶蛋白（Cas9）在crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）的引導下切割入侵的病毒基因組，從而在PAM[原型間隔序列毗鄰基序，來自釀膿鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenes，簡稱SpCas9）的NGG]上游3 bp處產(chǎn)生平末端DNA的雙鏈斷裂（DSB）并通過HNH（His-Asn-His）和RuvC核酸酶域分別獲得互補鏈和非互補鏈[7-9，13]（圖1）。另外，sgRNA（single-guide RNA）引導的R-loop（新生RNA與模板DNA通過堿基互補配對形成的雜合鏈和非模板DNA組成的三鏈結(jié)構(gòu)）保證了互補鏈PAM上游3 bp位置的精確切割[14-15]。編碼Cas蛋白的Cas基因通常位于以富集堿基AT的前導鏈為引導的CRISPR序列附近（圖1）[6，16]。

在植物細胞中，有2種共同表達多重引導RNA的方法，用于復雜基因組的編輯。一是采用基因傳遞方式，將多個向?qū)NA表達片段構(gòu)建到單獨的質(zhì)粒中，如基因槍法和聚乙二醇（PEG）介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染[17]。另一種是利用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化方法，將多個sgRNA組裝到1個載體上。這些sgRNA可以由單獨的啟動子驅(qū)動，或者通過植物內(nèi)源性核糖核酸酶進一步加工，以單轉(zhuǎn)錄本的形式表達[18-20]。這2種方法都是在植物基因組中引入基因修飾的有效方法。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的開發(fā)利用，使得基因組工程得到了驚人的進展[21-22]。靶基因的敲除或者敲入在多種物種和細胞類型中被證明是可行的[9，23]。通過編輯內(nèi)源性基因，開發(fā)出具有改良性狀的新植物或作物，以期克服傳統(tǒng)基因改造生物而產(chǎn)生的負面影響[24]?？紤]到不同的應用和生物系統(tǒng)，仍需要不斷地探索發(fā)現(xiàn)新的基因組編輯方法得到最合適的基因組編輯技術，從而推進各個領域的基因組發(fā)展。

2 CRISPRR/Cas系統(tǒng)在水稻中的應用發(fā)展

CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用Cas9核糖核酸內(nèi)切酶和向?qū)NA復合物，在許多物種中顯示了非常高效的靶向基因編輯能力。自2013年以來，CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)在植物中的成功應用越來越多，包括對擬南芥、煙草、高粱、小麥中的成功應用，以及在水稻、玉米、大豆、甜橙、毛白楊和番茄中的相關研究[17-18，25-33]。在水稻中，從T0代植株獲得高頻率的純合或雙等位基因是可行的，且在不出現(xiàn)任何可檢測到的新突變或回復突變的情況下，T0代植株中的基因修飾可以持續(xù)到下一代[27]。因此，CRISPR/Cas9技術讓編輯特定的基因以達到預期結(jié)果的設想成為可能。目前，已有許多研究報道CRISPR/Cas9技術在水稻抗病抗逆性，雜種優(yōu)勢以及產(chǎn)量性狀改良等方面的應用（表1）。

2.1 CRISPRR/Cas9系統(tǒng)在水稻抗病性中的應用

白葉枯病是我國水稻生產(chǎn)中的重要病害之一，是由白葉枯病菌引起的。該病菌在分蘗期感染植株導致葉片枯萎，嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。Jiang等構(gòu)建了一個由花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動子驅(qū)動的編碼鏈球菌Cas9酶和一個由水稻U6啟動子驅(qū)動的sgRNA，該sgRNA的5′區(qū)域與水稻白葉枯病敏感基因OsSWEET14啟動子區(qū)域中的20 bp序列互補[25]。通過聚乙二醇（PEG）轉(zhuǎn)化試驗，將Cas9酶和sgRNA共同轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體，并培養(yǎng)48 h，從而使 Cas9-sgRNA 改變目標內(nèi)源性基因OsSWEET14的位點。DNA測序證實了該水稻原生質(zhì)體細胞中靶位點的DNA序列發(fā)生突變。為了確定Cas9基因的密碼子優(yōu)化是否會影響Cas9-sgRNA定向誘變效率，Jiang等還利用一種水稻中優(yōu)化表達的Cas9基因，對另一個水稻白葉枯病基因OsSWEET11進行了試驗，并且也獲得了多個目標位點的突變[25];該研究成功證明Cas9-sgRNA系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)應用中是一種方便且有力的植物基因組編輯方法。

稻瘟病是水稻三大病害之一，由稻瘟病菌引起。稻瘟病幾乎可以破壞水稻不同生長階段的所有部位。考慮到稻瘟病的嚴重程度以及對水稻產(chǎn)量的影響，研究者們通過不同方面控制該病的發(fā)生，包括基因組學、感染機制研究、宿主病原體相互作用及抗性育種等。近年來，序列特異性核酸酶（SSNs）已被證明是通過基因特異性基因組編輯改進作物的有力工具，其中CRISPR/Cas9被認為是最有效的序列特異性核酸酶。Wang等設計了一個CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922）靶向水稻OsERF922基因，使水稻稻瘟病抗性提高;他們從50個T0代轉(zhuǎn)基因植株中鑒定出21個C-ERF922誘導突變的植株體，所有由C-ERF922蛋白誘導的等位基因突變都會遺傳給后代;進一步檢測6個T2代純合突變系的稻瘟病抗性表型和農(nóng)業(yè)性狀，發(fā)現(xiàn)在幼苗和分蘗時期，相比于野生型植株，6個突變體植株中稻瘟病病變顯著減少;結(jié)果表明，通過CRISPR/Cas9基因組修飾對增強水稻稻瘟病抗性是一個有效途徑[34]。Pi21是抗稻瘟病基因，因為與高堊白相關基因緊密連鎖，運用傳統(tǒng)方法難以獲得抗稻瘟病且稻米品質(zhì)優(yōu)良的植株。王芳權等選取Pi21的2個靶位點，構(gòu)建該基因的敲除載體，對其進行效率分析，發(fā)現(xiàn)2個靶位點突變效率分別為7857%和92.86%，靶位點同時突變的效率為 78.57%[35]。另外楊海河等利用日本晴對Pi20基因進行定點突變，也成功獲得了抗稻瘟病水稻株系[36]。這些研究結(jié)果證明了CRISPR/Cas9技術推動了抗稻瘟病品種的研究進展。

2.2 CRISPRR/Cas9系統(tǒng)在水稻抗逆性中的利用

2.2.1 耐鹽性 鹽脅迫對作物不同發(fā)育階段的生長都有影響，導致作物產(chǎn)量下降。隨著人口的快速增長，提高作物的耐鹽性是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率的關鍵措施。在擬南芥中，CBL5的過表達植株增強了對高鹽或干旱脅迫的耐受性，因此推測CBL5可能是植物中抗鹽抗旱性的調(diào)控因子[37]。在水稻中，陳鵬程運用CRISPR/Cas9獲得OsCBL5基因敲除純合突變體，發(fā)現(xiàn)其T0代的耐鹽性較野生型明顯提高[38]。董艷敏深入研究OsPDR1基因在水稻中的耐鹽性，利用CRISPR/Cas9技術定點編輯OsPDR1基因，從而得到該基因的突變株系[39]。與野生型相比，獲得的突變株的耐鹽性明顯提高。因此，CRISPR/Cas9技術為獲得更優(yōu)質(zhì)的抗鹽性品種提供了一條高效途徑。

2.2.2 抗寒性 水稻幼苗對低溫特別敏感，尤其在苗期。因此，提高水稻抗寒性對改善水稻品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。為了鑒定參與調(diào)控植物耐冷性的基因，黃小貞等利用由抑制消減雜交技術構(gòu)建的耐冷基因文庫進行篩選，得到一個可能與水稻耐寒性相關的轉(zhuǎn)錄因子TIFY 1b[40]。為了進一步研究TIFY 1b及其同源基因OsTIFY 1a，研究者利用CRISPR/Cas9技術成功構(gòu)建OsTIFY 1b及其同源基因TIFY 1a的敲除載體，且突變效率高;并在T0代水稻植株中觀察到位點特異性突變，且所有的突變類型都能穩(wěn)定遺傳到下一代[40]。該研究揭示了一種控制水稻抗寒適應性的新途徑，有助于拓寬轉(zhuǎn)基因抗寒水稻品種的研究范圍。

2.2.3 抗除草劑性 水稻BEL（bentazon sensitive lethal）基因?qū)Ρ竭_松和磺酰脲類除草劑具有抗性，BEL基因功能缺失突變體對除草劑敏感。在二系雜交水稻生產(chǎn)中，以BEL突變體為背景培育雄性不育系時，只需在苗期噴灑苯達松即可解決不育系自交雜交種子污染的問題。雖然BEL可能會提高雜交水稻的安全生產(chǎn)，但有限的自然遺傳資源極大地限制了BEL的應用[26]。Xu等設計了3種20-nt sgRNAs與水稻抗除草劑基因BEL的PAM序列附近的不同位點配對，將sgRNA與Cas9整合到一個載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化得到Cas9的轉(zhuǎn)基因水稻植株[26]。通過對轉(zhuǎn)基因植株基因組上靶位點的檢測，發(fā)現(xiàn)其突變效率為2%～16%，雙等位基因突變的株系表現(xiàn)為對苯達松敏感。

3-磷酸合酶（EPSPS）在所有植物和大多數(shù)細菌中都有保守的基序。這種基序?qū)τ诮Y(jié)合磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）或其競爭性抑制劑草甘膦至關重要。在保守基序中天然的雙氨基酸發(fā)生T102I+P106S的替換（雙氨基酸替換類型為TIPS）會產(chǎn)生對草甘膦的抗性。迄今為止，還沒有在栽培作物中發(fā)現(xiàn)自發(fā)或誘導的TIPS雙重突變，其原因可能是同時發(fā)生雙核苷酸替換的可能性很低。Li等用一對sgRNA靶向毗鄰的內(nèi)含子，獲得了2%的EPSPS基因替換頻率，以及2.2%的靶基因插入頻率[41]。獲得的水稻突變株均具有草甘膦抗性，并且特定位點的替換和插入可穩(wěn)定遺傳到下一代。這些新的途徑可以被廣泛運用到水稻或其他植物的特定基因組位點中，從而實現(xiàn)替換靶基因片段和插入內(nèi)源DNA序列。乙酰乳酸合成酶（ALS）是氯磺隆，雙草醚等除草劑中的關鍵酶，Sun等利用CRISPR/Cas9同源重組成功將多個離散的點突變轉(zhuǎn)入到水稻ALS基因中[42]。在該研究中不僅獲得了純合的抗除草劑的水稻植株，而且驗證了用該Cas9系統(tǒng)精確替換基因是可行且高效的。

因此，利用CRISPR/Cas9技術靶向關鍵功能基因有希望成為一種具有較大應用前景的促進水稻和其他主要作物育種的生物技術戰(zhàn)略。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻雜種優(yōu)勢中的利用

由于人口迅速增長、耕地有限和環(huán)境惡化等，人們對糧食的需求持續(xù)上升。雜交水稻已經(jīng)在40多個國家得到開發(fā)利用，在全球糧食供應中發(fā)揮著關鍵的作用[43]。采用三系和二系雜交育種體系開發(fā)的雜交水稻在我國雜交水稻生產(chǎn)中占主導地位[44]。三系法采用細胞質(zhì)雄性不育性（CMS），恢復系和保持系來生產(chǎn)雜交種子并維持不育系[45]。三系系統(tǒng)中恢復系和CMS的遺傳多樣性較低，阻礙了雜交育種的進一步發(fā)展。二系育種采用的是光敏核不育系（PGMS）或溫敏核不育系（TGMS）作為特定條件下的不育系或保持系。幾乎所有的水稻品種都能恢復PGMS和TGMS株系的育性，從而為更好地利用水稻雜種優(yōu)勢提供更廣泛的遺傳資源。在傳統(tǒng)的育種系統(tǒng)中，開發(fā)商業(yè)化的雄性不育系通常需要幾年時間，有時超過10年，而基因工程技術可以顯著縮短育種時間。Zhou等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，誘導溫敏核不育（TGMS）基因的特定突變，并且發(fā)展新的純合轉(zhuǎn)基因TGMS系;他們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在TMS5基因編碼區(qū)設計了10個靶點用于靶向誘變，并評估了靶向和脫靶效應的潛在發(fā)生率;此外，還建立了最有效的結(jié)構(gòu)——TMS5ab結(jié)構(gòu)（靶向TMS5a基因和TMS5b基因位點的二元結(jié)構(gòu)），用于培養(yǎng)潛在的純合轉(zhuǎn)基因TGMS系[46]。更值得關注的是，研究者利用TMS5ab結(jié)構(gòu)，在僅僅1年內(nèi)開發(fā)了11種新的轉(zhuǎn)基因TGMS純系，這些純系在雜交育種上都有潛在的應用前景[46]。上述研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅大大促進了TGMS系的育種進程，也促進雜種優(yōu)勢的開發(fā)利用。

一直以來，育種家們利用雜種優(yōu)勢生產(chǎn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的作物，但遺傳隔離的存在常常導致有益表型在后代中丟失。無融合生殖是利用種子進行無性繁殖的一種形式。通過無融合生殖可以實現(xiàn)F1代雜交種的自交繁殖。Khanday（來自美國加州大學戴維斯分校Venkatesan Sundaresan教授團隊）等證實了水稻雜交種無融合生殖的可行性，他們通過基因組編輯敲除BBM1、BBM2、BBM3這3個基因，結(jié)合卵細胞中BBM1基因的異位表達，獲得了克隆后代并保留了全基因組親代的雜合性，并且無融合生殖性狀可以通過多代克隆遺傳到下一代[47]。同一時期，我國水稻研究所王克劍團隊也通過對減數(shù)分裂基因REC8、PAIR1、OSD1進行CRISPR/Cas9基因組編輯，從而固定了F1雜交稻的雜種優(yōu)勢，獲得了無性系二倍體配子和四倍體的種子，并且證明了編輯參與受精過程的MTL（MATRILINEAL）基因可以誘導雜交水稻單倍體種子的形成;最后，同時編輯雜交水稻中REC8、PAIR1、OSD1、MTL這4個基因，將雜種優(yōu)勢的固定和單倍體的誘導結(jié)合起來，獲得了無融合生殖植株[48]。這些研究結(jié)果表明，基因編輯技術對于水稻雜交種實現(xiàn)無融合生殖具有重大意義，也為將來在多種作物中實現(xiàn)F1雜交種的無性繁殖奠定了基礎。

2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在改善水稻產(chǎn)量性狀中的應用

在現(xiàn)代水稻種植中，高產(chǎn)已成為近十年來育種家和種植者的主要目標之一。水稻單株產(chǎn)量由3種性狀決定：單株穗數(shù)、單穗粒數(shù)、粒質(zhì)量[49-50]。到目前為止，一些基因已被證明會影響這些產(chǎn)量性狀?？刂扑痉痔Y的有MOC1（Monoculm1O）、OsTB1（Teosinte Branched1）和IPA1（Ideal plant architecture1）[51-52];調(diào)節(jié)單穗粒數(shù)的有IPA1和Ghd7（Grains Height Date-7）、DST（drought and salt tolerance）、Gn1a（G rain number 1a）[52-54];調(diào)節(jié)籽粒大小的有GS3（Grain Size3）、GW2、GW5（Grain Weight 5）、OsSPL16（Squamosa Promoter Binding Protein-like 16）、OsPPKL1和OsglHAT1[55-61];控制穗型的有DEP1（Dense and Erect Panicle 1）[62]。Li等運用CRISPR/Cas9對水稻品種11號的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1基因進行突變，這些基因分別是用來調(diào)節(jié)水稻的單穗粒數(shù)、穗型、谷粒大小、株型[63]。分析T0代轉(zhuǎn)基因植株表型和編輯基因頻率的結(jié)果表明，用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可實現(xiàn)高效基因組編輯，轉(zhuǎn)基因植物效率分別為42.5%（Gnla）、67.5%（DEP1）、57.5%（GS3）、27.5%（IPA1）。Gn1a、DEP1和GS3突變體的T2代分別表現(xiàn)為谷粒數(shù)的增加、更緊湊直立的株型和較大的籽粒。并且在DEP1和GS3突變體中分別發(fā)現(xiàn)具有半矮稈和長芒谷粒表型的植株。其中IPA1突變體由于體內(nèi)OsmiR156靶區(qū)域的不同，表現(xiàn)為2種截然不同的表型：產(chǎn)生較少或者較多分蘗。Li等還發(fā)現(xiàn)缺失突變體發(fā)生的頻率高于之前的報道，且脫靶效應發(fā)生在高度相似的靶序列中[63]。這些結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可以在1個品種中修飾多個重要性狀的調(diào)控因子，從而促進對同一基因組背景下的復雜基因調(diào)控網(wǎng)絡剖析，并且為改善目前種植品種產(chǎn)量性狀提供了潛在的植物育種策略。

3 總結(jié)和技術展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)自2013年推出以來發(fā)展迅速，在糾正疾病突變、對抗病毒性疾病、解剖基因功能、癌癥研究、細胞基因組工程、藥物發(fā)現(xiàn)和疾病建模方面正獲得越來越大的影響力。最早在基因組工程中應用的釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）蛋白，雖然存在分子量大和潛在的脫靶效應等局限性，但由于其高核酸酶活性和廣泛的靶向范圍，仍被廣泛地應用。不可否認的是，CRISPR/Cas9大大擴展了基因組編輯的用途，例如基因敲除的全基因組篩選、轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活、利用不具有切割活性的dCas9與熒光蛋白融合進行染色體動力學分析[64-66]、利用dCas9表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)因子實現(xiàn)表觀基因組編輯和利用DNA條形碼技術對細胞譜系的跟蹤[67-68]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以防止細胞病毒（噬菌體）的感染，為細菌免疫開辟了一個新途徑。同時CRISPR能夠以更精確、更高效、更簡單的方式在基因組的靶序列上創(chuàng)造突變，已真正成為作物改良的最有效的工具。其主要優(yōu)勢在于，通過遺傳隔離可以很容易地從基因組中去除那些由轉(zhuǎn)基因技術引起的基因修飾，從而使經(jīng)過基因編輯的植物與通過傳統(tǒng)育種方法得到的植物之間沒有差異。此外，DNA甲基化和組蛋白修飾的表觀遺傳調(diào)控方式可以在不改變基因組序列的情況下遺傳給植物后代，因此在作物改良方面也有更大的應用前景。然而基因組編輯的應用仍存在不足，制約了其在水稻等多種作物中的進一步應用。因此，優(yōu)化基因編輯技術可以進一步促進作物改良的發(fā)展。

（1）降低CRISPR基因組編輯系統(tǒng)對PAM序列的要求。由于對PAM的要求非常嚴格，大大限制了可以編輯的序列，從而影響基因組編輯的效率。目前，化膿鏈球菌Cas9（SpCas9）主要是識別包含NGG的PAM位點[69]。最新開發(fā)的Cas9蛋白，其“D1135”“R1335”“T1337”氨基酸分別被位點“V”“Q”“R”替換（簡稱VQR變體），該變體被證明可以切割含NGA的PAM位點[70]。然而，該VQR變體的編輯效率較低，限制了其在基因組編輯中的廣泛應用。Hu等為了進一步擴大植物基因組編輯的范圍，通過改造sgRNA結(jié)構(gòu)和強內(nèi)源性啟動子，顯著提高了VQR變體的編輯效率[71]?？商鎿QPAM序列（3′ NAG和NGA）和Cas9變體（比如StCas9、SaCas9）拓寬了基因組編輯在植物中的應用[72]。使用幾個具有不同PAM特異性的Cas9變體，將有助于擴大基因組編輯的范圍。然而，并不是所有的Cas9變體在植物中都是有效的，Cas9變體仍有很大的發(fā)展空間，并且將有希望擴大谷類作物特別是水稻的基因組編輯范圍。

（2）需要提高基因替換編輯的效率。因為作物育種中需要的性狀是通過功能突變來實現(xiàn)的，通過同源重組（HR）途徑進行的序列置換和片段敲入實現(xiàn)的基因組編輯對作物改良具有更重要的意義。但是植物中HR的效率很低，導致通過HR途徑實現(xiàn)基因替換仍然很困難。因此需要基于HR途徑更高效的基因組編輯。優(yōu)化供體模板DNA的傳遞方式可能是獲得通過HR途徑實現(xiàn)基因替換編輯的有效途徑。

（3）不能直接在早期的農(nóng)地里獲得經(jīng)過基因組編輯的水稻和其他作物。突變植株在自然環(huán)境條件下的表現(xiàn)存在不確定性。解決這一問題需要對經(jīng)過編輯的植株進行更多的實地觀察。限制經(jīng)過基因編輯過的水稻應用的另一個因素是農(nóng)民田間生物安全條例。美國農(nóng)業(yè)部已經(jīng)免除了對許多轉(zhuǎn)基因作物的嚴格監(jiān)管[73]。歐盟法院最近裁定，使用基因組編輯技術創(chuàng)造的生物將作為轉(zhuǎn)基因生物進行管理。這可能會對水稻種植國家對轉(zhuǎn)基因水稻監(jiān)管的決定?？偠灾蚪M編輯技術可以在技術上創(chuàng)造出轉(zhuǎn)基因作物，CRISPR/Cas9和相關的基因組編輯工具的確在水稻改良方面帶來了革命性的變化，對于滿足并保證未來人們對水稻的需求具有重大意義。

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