天府肉鵝母系不同階段顆粒細胞內(nèi)參基因的選擇

莫遠亮，王郁石，王繼文

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130）

實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）是基于熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Cq值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析[1]的方法，該方法具有快速、靈敏性高、特異性強、通量大等特點，在當今生物學研究中被廣泛應(yīng)用。在RT-qPCR應(yīng)用中，由于不同樣品間RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率及PCR反應(yīng)擴增效率等存在差別，從而影響定量分析的準確性，因此需要引入穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因予以校正[2]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該是在所研究的組織、細胞和各種實驗條件下均能夠恒定表達的基因[3]。但是，由于內(nèi)參基因的表達具有物種、組織及階段特異性，不存在通用于多種細胞、組織和實驗條件的內(nèi)參基因。如若使用未經(jīng)篩選驗證的內(nèi)參基因進行校正，則目標基因表達水平的定量分析可能出現(xiàn)較大的偏差[4]。因此，需要根據(jù)細胞和組織類型、細胞增殖和器官發(fā)育的階段、實驗條件的不同，篩選出相對合適的內(nèi)參基因及確定其數(shù)目，對數(shù)據(jù)進行校正和標準化，以獲得準確可靠的基因表達分析[5]。

KHAN等[6]在對牛的優(yōu)勢卵泡顆粒細胞的內(nèi)參基因表達分析時發(fā)現(xiàn)，UBE2D2和EIF2B2在分娩期和卵泡成熟期表達較為穩(wěn)定。BADDELA等[7]對牛的顆粒細胞在不同氧濃度和不同密度培養(yǎng)條件下做了內(nèi)參基因的選擇，發(fā)現(xiàn)TBP和B2M在2種條件下均能穩(wěn)定表達。Lü等[8]為篩選在正常和多囊卵巢綜合征患者的顆粒細胞中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，從15個常用內(nèi)參基因中篩選出了HPRT1、PRLP0、HMBS3個穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。目前有關(guān)顆粒細胞內(nèi)參基因選擇的研究報道相對較少。顆粒細胞對禽類卵泡的生長發(fā)育至關(guān)重要，而禽類的卵泡發(fā)育遵循嚴格的等級發(fā)育制度[9-10]，因此，研究顆粒細胞在不同階段各基因的表達水平對探究禽類卵泡的選擇募集機制具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，部分常用內(nèi)參基因GAPDH、TUB、B2M在不同階段顆粒細胞中表達不穩(wěn)定。因此，本文以天府肉鵝母系卵泡顆粒細胞層為材料，選取常用的10個內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，利用RT-qPCR技術(shù)獲取內(nèi)參基因 的Cq值 ，采用 ΔCT法[11]、qbase+[12]、NormFinder[13]、BestKeeper[14]4種方法評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以期獲得在不同階段顆粒細胞中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，為后續(xù)相關(guān)研究中內(nèi)參基因的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的天府肉鵝母系來自四川農(nóng)業(yè)大學家禽育種場。本試驗選用3只健康的、開產(chǎn)時間和體質(zhì)量基本一致，處于產(chǎn)蛋高峰期的天府肉鵝母系母鵝。放血處死后，迅速取出整個卵巢，分離出不同直徑大小的卵泡，用游標卡尺測量不同卵泡橫軸直徑后，參照GILBERT等[15]所述方法分離不同階段（2～4 mm、4～6 mm、6～8 mm、8～10 mm、F5、F4、F3、F2、F1）卵泡顆粒細胞，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）漂洗3～4次，剪碎后置于－80℃冰箱中凍存，備用。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

采用RNAiso Plus（TaKaRa公司，日本）提取鵝卵泡顆粒層組織總RNA，利用NanoDrop 2000紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照RR047A型PrimeScriptTM（TaKaRa公司，日本）說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于－20℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.3 引物設(shè)計及標準曲線的構(gòu)建

根據(jù)文獻[16-22]報道，選擇GAPDH、ACTB、TUB、HMBS、HPRT1、UBC、TBP、SDH、18S、28S等10個常用內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，進行表達穩(wěn)定性分析。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，候選內(nèi)參基因的引物信息見表1。構(gòu)建標準曲線時，將cDNA模板按10倍濃度梯度稀釋為7個濃度后，進行RT-qPCR擴增，以獲取10個內(nèi)參基因引物的擴增效率。

表1 候選內(nèi)參基因引物信息Table 1 Primer information of candidate reference genes

1.4 實時熒光定量PCR

RT-qPCR在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上采用兩步法進行。RT-qPCR使用25 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqⅡ 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），cDNA模板 2.0 μL。RT-qPCR擴增條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火、延伸30 s，40個循環(huán)；熔解曲線為55～95℃，每5 s增加0.5℃，以檢測引物特異性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過CFX-Manager 3.1軟件獲得各個樣本的Cq值。根據(jù)公式Q＝EΔCT，其中，ΔCT＝CTmin－CT樣品，E為基因擴增效率，利用Excel 2013計算出每個擴增樣品的表達量Q。采用 ΔCT、qbase+（geNorm）、NormFinder、BestKeeper等方法綜合評價候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。由于每種方法基于不同的算法，使得所得到的結(jié)果可能會有差異，為了避免使用單一評價方法的片面性，因此可綜合使用多種評價方法[23]。本研究對4種分析方法所得到的評價排名取幾何均數(shù)，以最終的綜合排名指數(shù)來判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，該指數(shù)越小，則內(nèi)參基因表達越穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因引物特異性檢測

RT-qPCR熔解曲線分析結(jié)果如圖1所示，普通PCR擴增結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯飻U增片段單一，熔解曲線除主峰外沒有其他雜峰，說明無引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生，所用內(nèi)參基因引物均為特異性擴增。

2.2 標準曲線的構(gòu)建

以拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，Cq值為縱坐標作標準曲線。通過計算得知，10個內(nèi)參基因的擴增效率范圍為82.10%～108.68%，決定系數(shù)R2變化范圍為0.981～0.999（表2），表明各內(nèi)參基因在系列稀釋的濃度梯度內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3 內(nèi)參基因在顆粒細胞中的表達豐度分析

Cq值與基因的表達量呈反比，Cq值越大，基因的表達量越低；反之，Cq值越小，基因的表達量越高。圖3顯示，10個候選內(nèi)參基因在不同階段顆粒細胞中表達的Cq值在10～29之間，其中SDH和TBP的表達量較低，而18S、28S的表達量均較高。

圖1 候選內(nèi)參基因的RT-qPCR熔解曲線Fig.1 RT-qPCR melting curves of candidate reference genes

2.4 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

利用ΔCT法和qbase+、NormFinder、BestKeeper 3個軟件對候選內(nèi)參基因在9個不同階段顆粒細胞中的表達穩(wěn)定性進行分析，結(jié)果如圖4所示。ΔCT法是通過計算各基因的平均標準偏差（s）來確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，平均標準偏差越小，基因穩(wěn)定性越高，故最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為HMBS。qbase+（geNorm）可計算各候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值（M），M越小，基因穩(wěn)定性越高。NormFinder與geNorm程序相似，也是根據(jù)內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值（M）大小來判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。根據(jù)M值越小，表達越穩(wěn)定的原則，qbase+和NormFinder 2種方法得到的最穩(wěn)定內(nèi)參基因均為SDH。BestKeeper通過計算每個基因之間產(chǎn)生配對的相關(guān)系數(shù)（r），以標準偏差（s）和變異系數(shù)（CV）來判斷基因表達的穩(wěn)定性，相關(guān)系數(shù)越大，s和CV的值越小，表明基因表達越穩(wěn)定，當s＞1時，則該內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定，故最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為18S。用4種方法對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行分析所得到的結(jié)果不盡相同，因此需要對4種方法得到的結(jié)果進行綜合排序。對每一個內(nèi)參基因采用4種方法所得到的排名取幾何均數(shù)，得到最終的排名，結(jié)果見表3。在不同階段顆粒細胞中，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次為SDH、HMBS、18S，而穩(wěn)定性最差的3個內(nèi)參基因為UBC、GAPDH、TUB。

圖2 內(nèi)參基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of reference genes

表2 候選內(nèi)參基因的標準曲線Table 2 Standard curves of candidate reference genes

圖3 候選內(nèi)參基因在顆粒細胞中的Cq值Fig.3 Cqvalues for candidate reference genes in granulosa cell

圖4 基于不同方法的內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析結(jié)果Fig.4 Reference gene expression stability analysis by ΔCT(A),qbase+(B),NormFinder(C),BestKeeper(D)

表3 內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性綜合排序Table 3 Comprehensive ranking of reference gene expression stability

2.5 最佳內(nèi)參基因數(shù)目的確定

在qbase+中的geNorm程序還可利用標準化因子進行配對差異分析來評定所需內(nèi)參基因的最佳數(shù)目。V值為引入1個新的內(nèi)參基因后標準化因子的配對變異值（pairwise variation），當Vn/Vn+1＜0.15時，不再需要引入下一個內(nèi)參基因進行校正，則最佳內(nèi)參基因數(shù)為n個；而當Vn/Vn+1＞0.15時，需要引入下一個內(nèi)參基因進行校正，則最佳內(nèi)參基因數(shù)為n+1個。由圖5可以看出，V2/V3＜0.15，不需要引入第3個內(nèi)參基因，因此在不同階段顆粒細胞中的最佳內(nèi)參基因數(shù)為2個，結(jié)合以上內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析的結(jié)果，在不同階段顆粒細胞中，可使用HMBS和SDH作為內(nèi)參基因，同時可根據(jù)二者的校正因子的幾何均數(shù)算出最適的校正因子。

2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗證

圖5 最佳內(nèi)參基因數(shù)目的確定Fig.5 Determination of the optimal number of reference genes

為了進一步驗證篩選得到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，選取最穩(wěn)定的2個內(nèi)參基因（SDH和HMBS）來分析FSHR基因在不同階段顆粒細胞中的表達規(guī)律，同時選取表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因（UBC和GAPDH）作為對照。FSHR在禽類等級前卵泡活性維持及等級卵泡的選擇中起決定作用，F(xiàn)SHR在直徑為1～2 mm的卵泡顆粒層就已開始表達，在卵泡直徑為6～12 mm時表達量最高，而在等級卵泡顆粒層中逐漸降低[24-25]。圖6顯示，F(xiàn)SHR在鵝的顆粒細胞中表達也呈現(xiàn)出類似的規(guī)律，與使用GAPDH-UBC進行校正相比，使用SDH-HMBS進行校正得到的結(jié)果更符合FSHR的表達規(guī)律。在使用GAPDH-UBC進行校正后，F(xiàn)SHR在8～10 mm的卵泡顆粒層中表達量顯著降低，而在F3、F1階段則顯著高于SDHHMBS的校正結(jié)果。

圖6 FSHR在不同階段顆粒細胞中的表達分析Fig.6 Relative expression of FSHR in different periods of granulosa cells

3 討論

內(nèi)參基因是指其表達水平不受研究條件的影響，且可以在多種組織和細胞中穩(wěn)定表達的基因。但內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達是相對的，內(nèi)參基因的表達因物種、組織、細胞、階段和研究條件的不同而變化[26]。目前，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價主要通過geNorm、NormFinder、BestKeeper等系列軟件計算出相關(guān)參數(shù)來進行，并根據(jù)穩(wěn)定性高低進行排序。VANDESOMPELE等[12]于2002年編寫出一款基于Excel的geNorm程序，這是一款專門用于RT-qPCR分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性的軟件，作為第一個內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價軟件，在內(nèi)參基因的評價和篩選方面起到了重要作用，是目前使用較廣的內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評價軟件[27]。鑒于內(nèi)參基因穩(wěn)定性對RT-qPCR結(jié)果的重要性，后續(xù)又開發(fā)出了NormFinder、BestKeeper、ΔCT等多種方法，而這些評價方法均是通過不同的統(tǒng)計學方法來評定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性的，由于每種軟件的算法不同，可能導致用不同方法得到的內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果不盡相同[23]。為了避免使用單一方法評價造成的片面性，因此可綜合使用多種評價方法，對多種分析方法得到的評價排名取幾何均數(shù)，以最終的綜合排名指數(shù)來評定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，該指數(shù)越小，則該內(nèi)參基因越穩(wěn)定[28]。本研究采用4種方法分析了10個內(nèi)參基因在9個不同階段顆粒細胞中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在不同階段顆粒細胞中，最穩(wěn)定的3個內(nèi)參基因依次為SDH、HMBS、18S，而穩(wěn)定性最差的3個內(nèi)參基因依次為UBC、GAPDH、TUB。在獲得內(nèi)參基因的穩(wěn)定性之后，進一步利用geNorm程序計算出在不同階段顆粒細胞中最佳內(nèi)參基因數(shù)為2個，并確定SDH和HMBS為最佳內(nèi)參基因組合。

GAPDH作為在多個物種和組織中被廣泛使用的內(nèi)參基因之一，其穩(wěn)定性相對較好，然而在禽類不同組織和階段中的表達具有較大差異性。JI等[29]對籽鵝5個組織在5個生長發(fā)育時期做了內(nèi)參基因的選擇，發(fā)現(xiàn)28S、ACTB、HPRT1分別在心、腎、肌肉中表達最穩(wěn)定，而GAPDH在肝和卵巢中表達最穩(wěn)定。袁振杰等[30]對濟寧百日雞性腺軸在生長階段中6個不同時間點的內(nèi)參基因選擇進行了研究，發(fā)現(xiàn)下丘腦中表達最為穩(wěn)定的是GAPDH，而在卵巢中表達最為穩(wěn)定的是ACTB。計紅等[31]研究了籽鵝產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期組織內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)GAPDH在產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期均較為穩(wěn)定，而18S在產(chǎn)蛋期較為穩(wěn)定，在產(chǎn)蛋前期穩(wěn)定性較差。前期研究發(fā)現(xiàn)，GAPDH在不同階段顆粒細胞中表達不穩(wěn)定，GAPDH在等級前卵泡顆粒細胞中表達高于等級卵泡顆粒細胞，而GAPDH是糖異生、糖酵解中的關(guān)鍵基因，可能是由等級前卵泡顆粒細胞處在快速增殖過程中，細胞消耗的能量增加，GAPDH表達水平上調(diào)所致。SDH為琥珀酸脫氫酶控制基因，是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶。HMBS為羥甲基膽素合成酶控制基因，主要參與血紅素合成、卟啉代謝、轉(zhuǎn)移酶激活等過程。NASCIMENTO等[20]研究發(fā)現(xiàn)，HMBS和HPRT1在雞的胸肌中表達最穩(wěn)定，而TRFC和B2M的穩(wěn)定性最差。SAMIULLAH等[32]研究了產(chǎn)蛋母雞蛋殼形成過程中不同時間點內(nèi)參基因的選擇，發(fā)現(xiàn)HMBS和HPRT1在蛋殼形成不同時間點中表達最穩(wěn)定。ZHANG等[33]對黃羽肉雞的內(nèi)參基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)RPL13、GAPDH分別為肝和空腸中最佳內(nèi)參基因，HMBS為所有組織中表達較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。本研究以篩選出來的SDH和HMBS為內(nèi)參基因，所計算出的FSHR的表達量更為準確，由此可見，在鵝卵泡不同階段顆粒細胞中，以SDH和HMBS為內(nèi)參基因是合適的，而篩選出來的SDH和HMBS在不同階段顆粒細胞中穩(wěn)定表達也是相對的，還與鵝的生長日齡、產(chǎn)蛋狀況、生理狀態(tài)密切相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究綜合4種內(nèi)參穩(wěn)定性評價方法，成功從10個候選內(nèi)參基因中篩選出了在不同階段顆粒細胞中穩(wěn)定表達的2個內(nèi)參基因SDH、HMBS，以最穩(wěn)定的2個內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為標準化校正因子可得到更加準確的結(jié)果。