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    浙江省淳安縣中華蜜蜂蜂房球菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

    2019-07-08 06:06:30郭蕊董捷郭海坤李君竹王德前
    關(guān)鍵詞:蜂房淳安縣中蜂

    郭蕊,董捷,郭海坤,李君竹,王德前*

    (1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,杭州 310021;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,杭州 310021;3.浙江省淳安千島湖好清蜜蜜蜂專(zhuān)業(yè)合作社,杭州 311701)

    淳安縣隸屬于浙江省杭州市,屬山地丘陵區(qū),蜜源豐富,以野桂花、枇杷花、山茶花、油菜花為主。隨著精準(zhǔn)扶貧工作的開(kāi)展,淳安縣政府對(duì)當(dāng)?shù)氐闹腥A蜜蜂(又稱(chēng)為“中蜂”)飼養(yǎng)業(yè)十分重視并大力推廣。目前,該地區(qū)的中蜂養(yǎng)殖量大幅度增加,但與此同時(shí),各種蜜蜂傳染性疾病相繼爆發(fā),對(duì)中蜂的健康和蜂產(chǎn)品的安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[1],因此,做好病害流行病學(xué)調(diào)查,因地制宜采取有效防治措施顯得尤為重要。然而,中蜂最易感染的細(xì)菌傳染病——?dú)W洲幼蟲(chóng)腐臭病在淳安縣中蜂中的流行情況尚不明確。

    歐洲幼蟲(chóng)腐臭病(European foulbrood,EFB),簡(jiǎn)稱(chēng)“歐幼病”,是發(fā)生于蜜蜂幼蟲(chóng)和蛹中的一種惡性細(xì)菌性消化道疾病[2],在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生。歐幼病的病原主要為蜂房球菌(Melissococcus pluton)。中蜂一旦感染蜂房球菌,其傳播迅速,發(fā)病快,且遷延不愈。據(jù)報(bào)道,中蜂較意蜂更易感染,發(fā)病程度比西方蜜蜂更為嚴(yán)重[3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將歐幼病列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病[4]。研究表明,感染了蜂房球菌的蜜蜂幼蟲(chóng)化蛹后,病原仍可在蜂群內(nèi)繼續(xù)存活若干年,常常于春秋繁殖季節(jié)復(fù)發(fā);在生產(chǎn)中主要采取防治結(jié)合、以防為主的措施[4]。因此,對(duì)病原早期感染的檢測(cè)非常關(guān)鍵。蜂房球菌因其對(duì)培養(yǎng)條件要求嚴(yán)苛并存在顯著的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),所以很難分離出其單菌落[5-6],且細(xì)菌涂片鏡檢[7]、分離培養(yǎng)[8]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[9]等傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法滿足病原鑒定需要。

    本文以中蜂蜂房球菌的16S rRNA基因保守序列(登錄號(hào):AB61407.1)為模板設(shè)計(jì)引物,建立了快速檢測(cè)蜂房球菌的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法,并用于開(kāi)展淳安縣中蜂歐幼病的流行病學(xué)調(diào)查,為該地區(qū)制定歐幼病的防治措施提供科學(xué)依據(jù),并對(duì)當(dāng)?shù)刂蟹浣】导懊鄯滹曫B(yǎng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 樣品采集

    2017年11月1日至12月31日,根據(jù)中蜂場(chǎng)在淳安縣的分布密度,從該縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的34個(gè)中蜂場(chǎng)采集298群蜜蜂樣品;每群隨機(jī)取50~100只工蜂,裝入帶有煉糖的蜂籠中,活體蜜蜂經(jīng)CO2處理后立即用液氮冷凍,并置于-80℃冰箱中保存。

    1.1.2 主要試劑

    DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司;1 000 bp DNA標(biāo)志物、pMD19-T載體、BamHⅠ和HindⅢ(QuickCutTM)內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans2K Plus DNA標(biāo)志物、感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。無(wú)水乙醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn),分析純。

    1.2 歐幼病PCR檢測(cè)方法的建立

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)GenBank中蜂房球菌16S rRNA基因保守序列(登錄號(hào):AB61407.1),利用DNAStar和Oligo 6.24軟件設(shè)計(jì)F/R上下游引物(F:5′-GCGGCTCTC TGGTCTGTAACT-3′;R:5′-TGCTTAACCTCGCG GTCTT-3′),預(yù)計(jì)擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為548 bp,引物由江蘇省蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

    1.2.2 DNA的提取

    選擇感染蜂房球菌的中蜂幼蟲(chóng),經(jīng)液氮研磨,參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA,并保存于-20℃冰箱中。

    1.2.3 PCR退火溫度的優(yōu)化

    以提取的DNA為模板,參考所設(shè)計(jì)引物的退火溫度值,優(yōu)化PCR退火溫度。反應(yīng)體系(50 μL):DNA 1 μg,2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,按50~65℃設(shè)置溫度梯度,退火30 s,72℃延伸1.5 min,共35個(gè)循環(huán);最后,72℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,以選擇最適的退火溫度。以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

    1.2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切鑒定

    將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中,采用藍(lán)白斑篩選、BamHⅠ和HindⅢ雙酶切方法篩選包含插入片段的重組質(zhì)粒。雙酶切反應(yīng)體系(30 μL):10×QuickCut緩沖液3 μL,陽(yáng)性重組質(zhì)粒8 μL,BamHⅠ1 μL,Hind Ⅲ 1 μL,用ddH2O補(bǔ)足至30 μL。反應(yīng)條件:30℃溫育10 min;37℃溫育10 min。反應(yīng)結(jié)束后,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,然后對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST進(jìn)行比對(duì)。

    1.2.5 特異性試驗(yàn)

    以蜜蜂子囊球菌(Ascosphaera apis)、蜜蜂微孢子蟲(chóng)(Nosema apis)、幼蟲(chóng)芽孢桿菌(Paenibacillus larvae)和蜂房球菌陽(yáng)性樣品的DNA為模板,以本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物和最適退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以鑒定該方法的特異性。以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

    1.2.6 靈敏度試驗(yàn)

    利用NanoVue紫外分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度,然后將5 μL模板稀釋成拷貝數(shù)系數(shù)為1的質(zhì)粒溶液,并依次10倍稀釋至0.01 μL-1。每個(gè)稀釋度取1 μL作為模板進(jìn)行PCR,根據(jù)出現(xiàn)目的條帶模板的最大稀釋倍數(shù),確定模板濃度并推算最低檢出拷貝數(shù)。以1.2.4構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照;以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

    1.2.7 重復(fù)性及可靠性試驗(yàn)

    選擇12份已知陰、陽(yáng)性的DNA樣品,用已建立的方法重復(fù)檢測(cè)3次,驗(yàn)證該方法的重復(fù)性;選擇陽(yáng)性PCR產(chǎn)物按照1.2.4步驟進(jìn)行克隆測(cè)序比對(duì),驗(yàn)證該方法的可靠性。

    1.3 淳安縣歐幼病流行病學(xué)調(diào)查

    1.3.1 樣品處理

    在采集的298群蜜蜂樣品中每群隨機(jī)取30只工蜂混合研磨,按照1.2.2步驟提取DNA。

    1.3.2 病原檢測(cè)

    以1.3.1提取的DNA為模板,用1.2建立的方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

    1.3.3 數(shù)據(jù)分析

    利用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)298群中蜂樣品的蜂房球菌的感染情況,分析歐幼病在不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的陽(yáng)性檢出率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR檢測(cè)方法的建立

    2.1.1 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

    利用1.2.1設(shè)計(jì)的引物,以歐幼病陽(yáng)性樣品的DNA為模板,設(shè)置退火溫度為50~65℃,進(jìn)行PCR。結(jié)果(圖1)顯示,采用本研究建立的PCR方法可從歐幼病陽(yáng)性樣品DNA中擴(kuò)增出一條548 bp的特異目的條帶,其中,退火溫度從50℃到63.5℃均能擴(kuò)增出目的條帶。根據(jù)條帶的亮度及引物的特異性,本文選擇59℃作為歐幼病病原檢測(cè)的PCR退火溫度。

    圖1 PCR的退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperatures for PCR

    2.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

    采用TA克隆方法(original T A cloning kit)將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,獲得重組質(zhì)粒,將其命名為pMD19-T/M.pluton。重組質(zhì)粒pMD19-T/M.pluton經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后,電泳檢測(cè)到2個(gè)條帶,大小分別在500~750和2 000~3 000 bp之間(圖2),與PCR目的片段和pMD19-T質(zhì)粒片段長(zhǎng)度一致,符合預(yù)期。然后對(duì)重組質(zhì)粒pMD19-T/M.pluton進(jìn)行測(cè)序和BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),用該方法獲得的目的片段與蜜蜂蜂房球菌DAT561菌株的16S rRNA基因序列(登錄號(hào):AP018492.1)同源性為100%,說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,且利用已建立的PCR方法可特異性獲得預(yù)期產(chǎn)物。

    2.1.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

    利用NanoVue超微量分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度為275 ng/μL,經(jīng)換算相當(dāng)于拷貝數(shù)7.77×1010μL-1。以不同稀釋倍數(shù)的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR,結(jié)果表明,模板拷貝數(shù)從1到10號(hào)分別為108到10-1μL-1,均能擴(kuò)增出清晰、單一的目的條帶(圖3)。因此,所建立的PCR方法根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算最低檢測(cè)量為0.1 μL-1,對(duì)應(yīng)的模板濃度為3.44×10-10ng/μL。

    圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification result of recombinant plasmid of pMD19-T/M.plutonby double restriction-enzymedigestion

    圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of sensitivity test

    2.1.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

    以不同細(xì)菌DNA為模板,應(yīng)用已建立的PCR方法進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示:該方法僅特異性擴(kuò)增出蜂房球菌,擴(kuò)增產(chǎn)物大小在500~700 bp之間(圖4),與預(yù)期一致。而以A.apis、N.apis、P.larvae的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均無(wú)條帶,說(shuō)明該方法可特異性檢測(cè)蜂房球菌。

    2.1.5 重復(fù)性及可靠性驗(yàn)證結(jié)果

    應(yīng)用已建立的PCR方法對(duì)感染蜂房球菌和未感染該細(xì)菌的蜜蜂樣品重復(fù)檢測(cè)3次,獲得的檢測(cè)結(jié)果一致,表明本文建立的歐幼病PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性;對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn),該陽(yáng)性產(chǎn)物與NCBI公布的17段序列的部分結(jié)構(gòu)蛋白的16S rRNA同源性均在99%以上,說(shuō)明該方法的可靠性高。

    M:DL1000 DNA標(biāo)志物;1:蜜蜂子囊球菌;2:蜜蜂微孢子蟲(chóng);3:幼蟲(chóng)芽孢桿菌;4:陰性對(duì)照(ddH2O);5:蜂房球菌。M:DL1000 DNA marker;1:A.apis;2:N.apis;3:P.larvae;4:Negative control(ddH2O);5:M.pluton.

    2.2 淳安縣歐幼病流行病學(xué)調(diào)查分析

    2.2.1 檢測(cè)結(jié)果

    利用本文建立的方法對(duì)淳安縣的298群工蜂樣品進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,陽(yáng)性樣品的電泳條帶單一、清晰易辨(圖5)。經(jīng)統(tǒng)計(jì),總共有75份陽(yáng)性樣品,測(cè)序驗(yàn)證表明,有目的條帶的樣品均呈蜂房球菌陽(yáng)性,說(shuō)明該方法可應(yīng)用于歐幼病病原檢測(cè),且效果穩(wěn)定、可靠。

    2.2.2 歐幼病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

    對(duì)浙江省淳安縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的34個(gè)飼養(yǎng)點(diǎn)進(jìn)行歐幼病流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果(表1)顯示:該地區(qū)中蜂蜂群內(nèi)蜂房球菌總檢出率為25.2%;在17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中,僅有6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)未檢出蜂房球菌感染,說(shuō)明該地區(qū)約有64.7%的鄉(xiāng)鎮(zhèn)的中蜂攜帶有歐幼病病原;在11個(gè)存在蜂房球菌陽(yáng)性的鄉(xiāng)鎮(zhèn)中,有5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)蜂房球菌檢出率≥40%,分別為金峰鄉(xiāng)、臨岐鎮(zhèn)、安陽(yáng)鄉(xiāng)、宋村鄉(xiāng)和威坪鎮(zhèn)。

    圖5 部分樣品蜂房球菌的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Test results of some samples of M.pluton by PCR

    表1 中蜂樣品采集信息及蜂房球菌檢測(cè)結(jié)果Table 1 Information of collected samples and detection result of M.pluton

    3 討論

    由蜂房球菌引起的歐洲幼蟲(chóng)腐臭病因傳播迅速、發(fā)病快,容易感染中蜂且病情嚴(yán)重,給我國(guó)中蜂養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅。本研究建立的PCR檢測(cè)方法是基于蜂房球菌16S rRNA基因保守序列,并通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件而建立的。試驗(yàn)證實(shí),該方法特異性強(qiáng),靈敏度高(DNA檢出量最低為3.44×10-10ng/μL),對(duì)于進(jìn)一步精準(zhǔn)檢測(cè)蜜蜂蜂房球菌感染具有重要的指導(dǎo)意義。

    歐幼病的爆發(fā)具有明顯的季節(jié)性[10]。在我國(guó)南方,每年有2個(gè)高發(fā)期,一個(gè)是3月初至4月中旬,另一個(gè)是8月中旬至10月初。如果秋末冬初氣溫下降不明顯,歐幼病秋季發(fā)病的時(shí)間可能會(huì)延長(zhǎng)[4]。本文選擇在秋末冬初時(shí)開(kāi)展淳安縣歐幼病的調(diào)查,明確致病菌——蜂房球菌在中蜂蜂群內(nèi)的攜帶情況,可為春繁時(shí)期病害防控措施的制定提供參考。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn),在淳安縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中有11個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的M.pluton感染呈陽(yáng)性,說(shuō)明歐幼病病原在該地區(qū)的中蜂中普遍存在。在采樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn),金峰鄉(xiāng)和宋村鄉(xiāng)蜂場(chǎng)出現(xiàn)“花子”脾面、蟲(chóng)體腐爛帶酸臭味[11]等現(xiàn)象,這與歐幼病典型癥狀吻合,其他一些蜂群也有發(fā)病跡象但癥狀特點(diǎn)不明顯。由于此時(shí)正值蜜蜂病毒病中蜂囊狀幼蟲(chóng)病的高發(fā)時(shí)期,蜂群如果感染該病后會(huì)導(dǎo)致消化系統(tǒng)功能紊亂和免疫力降低,如果再遇到暖冬氣候,便為M.pluton提供了適宜的繁殖條件,將出現(xiàn)蜂群細(xì)菌與病毒混合感染的復(fù)雜病癥。因此,細(xì)菌病與病毒病混合感染的現(xiàn)象需引起重視,及早干預(yù)病害發(fā)展進(jìn)程,減少對(duì)蜂群健康發(fā)展的影響。

    總之,本研究建立了中蜂歐幼病PCR檢測(cè)方法,靈敏性很高,且利用該方法明確了秋末冬初M.pluton在淳安縣的感染情況,為該地區(qū)制定歐幼病防治措施提供了數(shù)據(jù)支撐。但本研究?jī)H在一個(gè)時(shí)期對(duì)千島湖地區(qū)M.pluton感染做了流行病學(xué)調(diào)查,為了深入了解該地區(qū)歐幼病發(fā)病情況,有待進(jìn)一步對(duì)該病的病原進(jìn)行季節(jié)性動(dòng)態(tài)檢測(cè)。另外,在實(shí)際生產(chǎn)中,中蜂病害的爆發(fā)往往并非單一病原感染所致,所以加強(qiáng)多種病原混合感染的檢測(cè),尤其是細(xì)菌與病毒混合感染的快速檢測(cè)方法有待開(kāi)發(fā)。

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