重組人乙酰膽堿酯酶基因在畢赤酵母中分泌表達及其對農(nóng)藥的敏感性評估

楊芳芳，李佳慧，張賽南，王珍，廖志銀，王首鋒,3*

（1.浙江大學基礎醫(yī)學系，杭州 310058；2.綠城農(nóng)科檢測技術有限公司，杭州 310052；3.浙江省微生物生化與代謝工程省級重點實驗室，杭州 310058）

在過去30年間，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥在全世界得到了廣泛的應用，由此引發(fā)了許多的食品安全問題[1-3]。我國是農(nóng)業(yè)大國，為了提高糧食產(chǎn)量，對農(nóng)藥的依賴性越來越強，而有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有高效、低毒、低殘留、防治效果好、防治對象多、應用范圍廣等特點，是目前使用最廣泛的一類農(nóng)藥。有研究表明，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥在特定的環(huán)境下會在食品中殘存較長的時間，既可以在水果、蔬菜等農(nóng)作物中殘留，也可以在動物體內累積。為了提高產(chǎn)量和防治病蟲害而大量施用農(nóng)藥使得農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留超標的現(xiàn)象非常嚴重，給食品安全和人類健康造成了嚴重的威脅[4]，因此，找到快速檢測農(nóng)藥殘留方法對于控制食品安全隱患具有重要意義。

酶抑制法是目前檢測有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的主要技術，具有簡便、靈敏、經(jīng)濟、快速的特點。在酶抑制法中酶最為關鍵。酶抑制法的基本原理[5]如下：在正常生理情況下，乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase,AChE）可以選擇性水解乙酰膽堿成為膽堿和乙酸。而有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能夠特異性抑制乙酰膽堿酯酶的活性，因此，乙酰膽堿酯酶成為酶抑制法的關鍵酶。將乙酰膽堿和乙酰膽堿酯酶吸附在濾紙片上，加入特定顯色劑后，根據(jù)濾紙片顏色的變化來判斷酶反應產(chǎn)物生成量的多少，進而判定樣品中是否存在有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥[6]。酶抑制法所用酶包括乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶和動物與植物酯酶，其中乙酰膽堿酯酶對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥較為敏感，測定的靈敏度高，選擇性強，因而被廣泛使用[7-9]。

已有研究表明，人乙酰膽堿酯酶（human acetylcholinesterase,hAChE）對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的雙分子速率常數(shù)較其他幾種來源的酶要高，敏感性更強[10-13]，故本研究以人乙酰膽堿酯酶為研究對象。近年來，已有從不同生物組織中提取并純化AChE的報道[14-18]。然而，通過這些方法得到的AChE不僅含量低，而且存在時間成本高和純化復雜等問題。目前，已有在畢赤酵母中成功分泌表達了AChE的報道[19]，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)AChE提供了可能。本研究在畢赤酵母中成功分泌表達了hAChE，根據(jù)改良的Ellman酶活測定方法，測定了市面上常見的8種農(nóng)藥對hAChE的酶抑制率，進而評估了hAChE對8種農(nóng)藥的敏感性大小，為農(nóng)藥殘留快速檢測的關鍵酶——人乙酰膽堿酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

pReceiver-M02-hAChE-ORF質粒購自廣州易錦生物技術有限公司；pPIC9K-top10菌株為浙江大學化學工程與生物工程學院姚政博士所贈；DH5α和GS115菌株為浙江省微生物生化與代謝工程省級重點實驗室所保存。

1.1.2 試劑

高保真DNA聚合酶（TaKaRa PrimeSTAR HS DNApolymerase）、SnaBⅠ和AvrⅡ（BlnⅠ）限制性內切酶和DNA聚合酶（EasyTaq）均購自寶生物工程（大連）有限公司；割膠純化試劑盒、聚合酶鏈式反應產(chǎn)物純化試劑盒和T4 DNA連接酶試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；陰離子交換色譜（Q-Sepharose fast flow chromatography）購自瑞典Amersham公司；樂果（98.6%）、敵敵畏（99.3%）、甲胺磷（98.6%）、敵百蟲（99.2%）、馬拉硫磷（99.5%）、甲萘威（98.7%）、毒死蜱（99.4%）、克百威（98.4%）等8種農(nóng)藥標準品均購自北京世紀奧科生物技術有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

細菌基礎（Luria-Bertani,LB）培養(yǎng)基，酵母膏蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium,YPD），最小葡萄糖培養(yǎng)基（minimal dextrose medium,MD）；畢赤酵母誘導表達前培養(yǎng)基——緩沖復合甘油培養(yǎng)基（buffered minimal glycerol-complex medium,BMGY），畢赤酵母誘導表達培養(yǎng)基——緩沖復合甲醇培養(yǎng)基（buffered minimal methanolcomplex medium,BMMY），培養(yǎng)基配方參照美國Invitrogen公司畢赤酵母表達手冊。

1.2 方法

1.2.1hAChE基因克隆

根據(jù)GenBank公布的人乙酰膽堿酯酶基因序列（NM_000665.4）設計引物 F1和 R1（表1）。以pReceiver-M02-hAChE-ORF質粒為模板，以特異性引物F1和R1進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）。PCR反應體系（50 μL）如下：5×PCR 緩沖液 10 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）8 μL，引物 F1（10 μmol/L）0.5 μL，引物R1（10 μmol/L）0.5 μL，模板0.5 μL，TaKaRa PrimeSTAR HS DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 30 μL。PCR條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，65.1℃退火1 min，72℃延伸3 min，31個循環(huán)；最后，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化后待用。

1.2.2 表達載體pPIC9K-hAChE的構建、轉化與篩選

由于在hAChE基因中不包含pPIC9K多克隆位點處的常用酶切位點，因此可以使用傳統(tǒng)的酶切連接方法將hAChE基因克隆至pPIC9K載體上。先用SnaBⅠ和AvrⅡ分別雙酶切hAChE基因和pPIC9K載體，使其具有相同的黏性末端。對雙酶切純化后的hAChE基因和pPIC9K載體片段利用T4 DNA酶連接體系進行載體構建，其連接反應體系如下：目的片段（75 ng/μL）3 μL，pPIC9K 載體片段（50 ng/μL）1 μL，10×連接緩沖液 1 μL，50% 聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）1 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，ddH2O 3 μL。于16 ℃條件下連接12 h，取5 μL反應液用熱激法轉化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)菌株中，將轉化液涂布在100 μg/mL氨芐西林LB平板上，于37℃條件下倒置過夜培養(yǎng)，并將通過菌落PCR和雙酶切驗證為陽性的轉化子[20]送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

表1 人乙酰膽堿酯酶基因克隆、測序及菌落PCR鑒定所用的引物序列Table 1 Primer sequences for hAChE gene cloning and colony PCR analysis

將構建好的重組質粒pPIC9K-hAChE經(jīng)SalⅠ限制性內切酶線性化后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行線性核酸片段回收，得到高濃度線性化的重組質粒片段，采用Eporator 2510電穿孔儀（Eppendorf公司，德國）將其電轉化至畢赤酵母GS115菌株中。

采用組氨酸缺陷型的MD平板[1.34%酵母氮源，2%葡萄糖，（4×10－5）%生物素，1.5%瓊脂]篩選出發(fā)生同源重組的His＋轉化子。用無菌水將平板上的轉化子洗下并涂布在含G418（抗性梯度分別為0.25、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的YPD平板（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）上，進行多拷貝重組菌篩選。

1.2.3 重組酵母GS115/pPIC9K-hAChE的菌落PCR鑒定

從含G418（抗性梯度4.00 mg/mL）的YPD平板上挑取單克隆并接種于YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后 ，取200 μL 培養(yǎng)液，以 1×104r/min 離心5 min。棄上清液，用等體積（200 μL）無菌水洗3次后，用50 μL無菌水重懸菌體，然后取1 μL菌體作為PCR模板，并以重組質粒pPIC9K-hAChE作為陽性對照模板。反應體系按照寶生物工程（大連）有限公司的EasyTaq酶說明書進行，并將PCR產(chǎn)物進行核酸電泳鑒定。

1.2.4 重組酵母GS115/pPIC9K-hAChE的誘導表達

將菌落PCR鑒定為陽性的GS115/pPIC9K-hAChE重組酵母接種于50 mL BMGY中，在30℃條件下振蕩培養(yǎng)至D（600 nm）＝2.0～6.0，于室溫、3 000g條件下離心5 min，棄上清液，菌體用BMMY重懸至D（600 nm）＝1.0。上述菌懸液于30℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每12 h取樣3 mL，同時補加無水甲醇至占終體積的0.5%，誘導表達144 h后，以1×104r/min離心10 min，收集發(fā)酵上清液，經(jīng)三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）沉淀后，以濃縮膠5%、分離膠12.5%進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析，并用Bradford法測蛋白濃度[21-22]。

1.2.5 表達產(chǎn)物的純化

根據(jù)ExPASy數(shù)據(jù)庫（Compute pI/Mw tool）信息得知，hAChE蛋白的等電點為5.87，因此，采用陰離子交換層析法對表達產(chǎn)物進行純化。為了從發(fā)酵液中得到純度更高的hAChE目的蛋白，本研究使用QSepharose FF陰離子交換層析柱進行純化，然后用Sephadex G-25進行脫鹽處理。Q-Sepharose FF陰離子交換層析柱先經(jīng)過0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）緩沖液進行預平衡。將離心后的發(fā)酵上清液上柱后，用分別含0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）緩沖液梯度洗脫，平均流速1.2 mL/min，分別收集各峰的產(chǎn)物，并進行SDSPAGE檢測。將含目的蛋白的收集產(chǎn)物用Sephadex G-25進行脫鹽處理。純化脫鹽后的產(chǎn)物用Bradford法進行蛋白濃度的測定[21-22]。

1.2.6 重組酵母表達產(chǎn)物酶活測定

酶活性測定參照改進的Ellman法[23-24]。作為底物的碘化硫代乙酰膽堿被乙酰膽堿酯酶分解為乙酸和硫代膽堿，接著硫代膽堿與5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]作用，生成一種黃色的絡合物，然后利用酶標儀在412 nm波長處測其光密度值。由酶促反應的初速率來確定酶活性。具體操作步驟如下：分別吸取64 μL發(fā)酵表達上清液和16 μL磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4），加入96孔板中，充分混勻，于30 ℃條件下孵育15 min后，立即加入 20 μL 1.25 mmol/L Ellman試 劑（1.25 mmol/L ATChI，1.25 mmol/L DTNB，0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.4）后混勻，并立即將混合液置于酶標儀中，在412 nm波長處進行比色，每隔30 s讀數(shù)一次，連續(xù)測定3 min。根據(jù)1 min內在412 nm處值的變化來計算酶活力。以80 μL磷酸鈉緩沖液加20 μL 1.25 mmol/L Ellman試劑的混合液作為空白對照。酶活力單位（U）定義為每分鐘產(chǎn)生1 nmol硫代膽堿為1個酶活力單位。酶活力用體積比酶活來衡量。計算公式如下：

式中：Δ412為在412 nm處反應前后吸光度的變化值；a為酶的稀釋倍數(shù)；ε為消光系數(shù)[1.36×104L/(mol·cm)]；t為反應時間，min；d為光程，cm；V為反應體系總體積，mL；Ve為反應體系中酶液的體積，mL。

1.2.7 農(nóng)藥敏感性試驗

用0.1 mol/L pH 7.4磷酸鈉緩沖液分別將8種農(nóng)藥標準品配成1 mg/mL的母液，并用磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）分別進行逐級梯度稀釋，最終配制成一系列反應梯度為1、1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6mg/mL的農(nóng)藥反應液。取每種質量濃度農(nóng)藥反應液16 μL代替1.2.6中酶活測定反應體系中的磷酸鈉緩沖液，于30℃條件下孵育15 min后，立即加入 20 μL 1.25 mmol/L Ellman 試劑，充分混勻后，立即將混合液置于酶標儀中，在412 nm波長處進行比色，每隔30 s讀數(shù)一次，連續(xù)測定3 min。以16 μL對應農(nóng)藥反應液+64 μL磷酸鈉緩沖液+20 μL 1.25 mmol/L Ellman試劑作為每次測定的空白對照。以磷酸鈉緩沖液代替農(nóng)藥反應液作為無農(nóng)藥抑制酶活對照。計算每種農(nóng)藥的酶活抑制率，比較每種農(nóng)藥的半抑制濃度（50%inhibitory concentration,IC50）。

式中：E1為未加農(nóng)藥時對照組反應體系的酶活；E2為有農(nóng)藥抑制時反應體系的酶活。

根據(jù)每種農(nóng)藥系列質量濃度梯度對hAChE發(fā)酵上清液的酶抑制率，繪制每種農(nóng)藥質量濃度-酶抑制率曲線，由此比較得出8種農(nóng)藥對hAChE的IC50大小。

2 結果與分析

2.1 hAChE基因克隆結果

采用特異性引物F1和R1，以pReceiver-M02-hAChE-ORF質粒為模板，經(jīng)過高保真酶Prime-STAR HS DNA聚合酶特異性PCR擴增后，得到約1.8 kb大小條帶，與預期大小相符（圖1）。

圖1 hAChE基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplified PCR product of hAChE gene

2.2 表達載體pPIC9K-hAChE的構建分析

由于在hAChE基因中不包含pPIC9K多克隆位點處的常用酶切位點，因此本研究使用傳統(tǒng)的酶切連接方法將hAChE基因克隆至pPIC9K載體上。重組載體pPIC9K-hAChE構建完成后，將經(jīng)菌落PCR驗證為陽性轉化子（圖2）的測序結果用Lasergene軟件中的MegAlign程序進行序列比對分析，結果表明，目的基因與從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載序列的一致性達100%。證明在PCR過程中沒有引入堿基突變，目的片段為人乙酰膽堿酯酶基因，載體構建與預期結果相符。同時，生物信息學分析表明，該基因編碼614個氨基酸，蛋白質分子質量為65 kDa，等電點為5.87。

圖2 重組表達載體pPIC9K-hAChE陽性菌落的PCR鑒定結果Fig.2 PCR identification result of recombinant expression vector pPIC9K-hAChE positive colony

2.3 表達載體pPIC9K-hAChE的轉化與篩選分析

將線性化的pPIC9K-hAChE電轉GS115后，經(jīng)MD平板篩選His＋重組轉化子，該重組轉化子再分別經(jīng)0.25、1.00、2.00、4.00 mg/mL的G418篩選，結果如圖3所示：隨著G418抗性梯度增加，克隆數(shù)逐步減少，最終從4.00 mg/mL G418培養(yǎng)基上篩選到了具有抗性的高拷貝重組菌株。

2.4 重組酵母GS115/pPIC9K-hAChE菌落的PCR鑒定結果

從含4.00 mg/mL G418的YPD平板上挑取高拷貝單克隆，以特異性引物F1和R1進行菌落PCR鑒定，結果擴增出一條1.8 kb大小的條帶（圖4），大小與預期相符。表明pPIC9K-hAChE已經(jīng)整合到酵母染色體上。

圖3 重組酵母GS115/pPIC9K-hAChE的G418抗性平板篩選結果Fig.3 Screening results of G418 resistant plates of recombinant yeast GS115/pPIC9K-hAChE

1：DL2000 DNA標志物；2：重組hAChE抗性酵母菌株陽性菌落的PCR產(chǎn)物。1:DL2000 DNA marker;2:Positive colony PCR product of recombinant hAChE resistant yeast strain.

2.5 hAChE重組蛋白的表達與純化分析

重組表達菌株GS115/pPIC9K-hAChE在0.5%甲醇、30℃條件下誘導表達144 h，每12 h進行取樣，同時補加無水甲醇至占終體積為0.5%，以1×104r/min離心5 min，收集發(fā)酵表達上清液。取1 mL上清液進行TCA沉淀處理，進行SDS-PAGE蛋白分析。結果（圖5）表明，在65 kDa處有重組蛋白條帶出現(xiàn)，與預期蛋白相對分子質量大小相符，且在144 h處蛋白表達量最高。由圖6可知，從96 h后發(fā)酵上清液的酶活趨于穩(wěn)定。取表達量最高的144 h處的發(fā)酵上清液進行Q-Sepharose FF陰離子交換層析柱純化，結果（圖7）表明，純化效果較理想。用Bradford法對發(fā)酵上清液中蛋白質量濃度測定表明，菌株GS115/pPIC9K-hAChE的總蛋白質量濃度為23.825 mg/mL，純化后的蛋白質量濃度為1.330 mg/mL，占總蛋白的5.58%。純化后的hAChE比酶活達到1 080 nmol/(min·mL)。

2.6 農(nóng)藥敏感性試驗結果

如圖8所示，計算8種常見農(nóng)藥對hAChE酶的抑制率，得出8種農(nóng)藥對hAChE的IC50，從大到小依次為敵百蟲＞敵敵畏＞克百威＞馬拉硫磷＞樂果＞甲胺磷＞甲萘威＞毒死蜱。說明該酶對毒死蜱最敏感。

3 討論

圖5 發(fā)酵上清液蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant protein

圖6 發(fā)酵上清液酶活-時間曲線Fig.6 Enzyme activity-time curve of fermentation supernatant

酶抑制法是通過一種逆向思維的方法來檢測在農(nóng)藥中占主要比例的有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法[25-26]。由于有機磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑能特異性抑制乙酰膽堿酯酶的活性，阻斷乙酰膽堿的水解，使乙酰膽堿在突觸間隙積累并引起昆蟲中毒死亡，因此，乙酰膽堿酯酶是有機磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標。目前，影響該方法大量推廣的主要原因是酶的來源有限，而且產(chǎn)量低，對農(nóng)藥的敏感性不高等。而經(jīng)真核或原核表達體系可生產(chǎn)具有生物學活性的重組人乙酰膽堿酯酶[27]。其中畢赤酵母真核表達體系在蛋白質表達方面具有高密度發(fā)酵培養(yǎng)、可分泌表達和利于純化、外源基因表達穩(wěn)定、啟動子強度大、表達量高和糖基化程度低等優(yōu)點而得到越來越廣泛的應用[28]。

圖7 純化后的目的蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified target protein

圖8 8種常見農(nóng)藥對hAChE抑制率大小比較Fig.8 Comparison of inhibitory rates of eight common pesticides on hAChE

本實驗通過畢赤酵母表達系統(tǒng)獲得了人乙酰膽堿酯酶，為了更好地將其運用到農(nóng)藥殘留快速檢測領域，對其酶活大小和其對農(nóng)藥的敏感性進行了測定。由于同一種酶對不同種類的農(nóng)藥敏感性不同，因此，為了更準確地表征該酶源的農(nóng)藥敏感性，本實驗針對市面上最常見的8種農(nóng)藥標準品進行了農(nóng)藥敏感性測定。

由于目前利用基因工程發(fā)酵手段大量生產(chǎn)敏感型乙酰膽堿酯酶技術還存在酶活不高、酶穩(wěn)定性差和酶純度低等問題，所以基于本實驗的研究結果，下一步將利用體外定點突變技術從酶活、穩(wěn)定性方面進一步提升酶的性能，為食品中農(nóng)藥殘留快速檢測技術的工業(yè)化應用提供更優(yōu)質的酶源。

4 結論

本文通過構建人乙酰膽堿酯酶基因高效表達工程菌，在實驗室階段進行甲醇誘導表達，并對發(fā)酵上清液進行初步純化和SDS-PAGE分析，結果發(fā)現(xiàn)，在65 kDa處有特異性蛋白條帶出現(xiàn)，大小與預期結果相一致。用Bradford法測得發(fā)酵上清液中hAChE蛋白質量濃度為1.330 mg/mL，占總蛋白的5.58%；純化后的hAChE比酶活達到1 080 nmol/(min·mL)。通過初步計算比對該重組工程菌發(fā)酵上清液對8種常見農(nóng)藥的IC50，得出敵百蟲＞敵敵畏＞克百威＞馬拉硫磷＞樂果＞甲胺磷＞甲萘威＞毒死蜱，即本實驗獲得的人乙酰膽堿酯酶對毒死蜱最敏感。