簡單重復(fù)序列標記和序列相關(guān)擴增多態(tài)性標記在草莓遺傳多樣性分析中的比較

忻雅，方獻平,2，王淑珍，童建新，來文國，汪建榮，余紅*

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310024；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海 201403）

我國的草莓產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的41.7%，是草莓生產(chǎn)第一大國[1]。草莓屬（Fragaria）約有20個種，包括二倍體、四倍體、六倍體和八倍體種，其中僅起源于美洲種的弗州草莓和智利草莓自然雜交的八倍體鳳梨草莓（Fragaria×ananassa）用于栽培。我國雖然分布著豐富的野生草莓資源，近幾年也育成了108個自有品種[2]，但生產(chǎn)上應(yīng)用的主要栽培品種多數(shù)引自國外。鳳梨草莓遺傳基礎(chǔ)較狹窄，尤其在營養(yǎng)生長階段，品種表型非常相似。草莓主要通過匍匐莖進行營養(yǎng)繁殖，不同地區(qū)引進相同品種，或者地區(qū)之間頻繁引種，使得品種名稱十分混亂，同物異名和同名異物的現(xiàn)象非常普遍[3]，給草莓品種的鑒定和種質(zhì)資源的遺傳多樣性評價帶來了很大的困擾。

對草莓種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行準確而客觀的評價，分析其親緣關(guān)系，可為資源引選、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢水平的預(yù)測提供指導(dǎo)。分子標記已成為植物遺傳多樣性研究的重要工具，已有多種DNA分子標記應(yīng)用于草莓種質(zhì)資源的研究[4-5]。早期應(yīng)用于草莓上的分子標記有擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）[6-7]、隨 機擴增多態(tài)性DNAs（randomly amplified polymorphic DNAs,RAPD）及特定序列擴增（sequence characterized amplified regions,SCAR）標記[8-9]。而簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat,SSR）標記具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復(fù)性高、實驗操作方便等特點，是近年來草莓遺傳育種研究中主要使用的標記，已廣泛用于草莓品種遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析中[10-12]。序列相關(guān)擴增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism,SRAP）標記是近年來發(fā)展的基于聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的新型分子標記，其目標是檢測基因組中的開放閱讀框（open reading frame,ORF）的多態(tài)性，是一種無須任何序列信息即可直接進行PCR擴增的新型分子標記技術(shù)[13]，它既克服了RAPD重復(fù)性差的缺點，又克服了AFLP技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴的缺點，以其操作簡便迅速、成本低、可靠性好、重復(fù)性高等特點被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位克隆等方面[14]。已有研究表明，SRAP標記提供的信息量較SSR和AFLP更為豐富，具有更高的分辨能力[15-16]。但這種新型的分子標記技術(shù)在草莓上并未得到廣泛應(yīng)用，國內(nèi)僅1篇關(guān)于其體系優(yōu)化和引物篩選的報道[17]。因此，有必要研究SRAP在草莓親緣關(guān)系分析中的可行性。此外，在以往草莓資源分析中多采用單一分子標記，而單一標記分析存在一定局限性[18]。因此，本研究利用SSR和SRAP標記對國內(nèi)外43份草莓材料進行遺傳多樣性分析，并比較2種標記在其中的差異，以期為草莓品種選育、資源保存和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草莓品種共43份（表1），包括3份野生型草莓品種、32份八倍體的紅草莓品種、3份白草莓品種、4份日中性草莓品種和1份十倍體草莓品種。品種材料由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所草莓育種團隊收集并提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

準備43份不同草莓品種材料，各取幼葉約0.5 g，在液氮中碾磨成粉狀，然后按Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]操作說明提取總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質(zhì)量和完整性，將樣品質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，保存于－20℃冰箱中，用于PCR擴增。

1.2.2 SSR-PCR

根據(jù)相關(guān)文獻報道的序列[19]，合成了38對SSR引物（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2018.10.261）。對SSR引物退火溫度（50～64℃）進行梯度PCR測試，以確定不同SSR引物的適宜退火溫度。SSR-PCR的反應(yīng)體系（15 μL）包括：2 μL預(yù)混液（含Mg2+和Taq酶），1 μL DNA（50～100 ng），0.6 μL上、下游引物（0.4 μmol）和10.8 μL ddH2O。擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，適宜溫度退火45 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表1 供試草莓材料Table 1 Strawberry cultivars used in this study

1.2.3 SRAP-PCR

根據(jù)SRAP引物的設(shè)計原理[13]，設(shè)計和合成了上游與下游引物各8條，組成64對引物（附表2，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2018.10.261）。SRAP-PCR的反應(yīng)體系（15 μL）包括：2 μL預(yù)混液（含Mg2+和Taq酶），1 μL DNA（50～100 ng），0.6 μL 上、下游引物（0.4 μmol）和10.8 μL ddH2O。擴增條件為：94 ℃變性5 min；前5個循環(huán)94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸1 min；隨后30～35個循環(huán)將復(fù)性溫度提高到50℃，最后延伸5～7 min。

1.2.4 擴增產(chǎn)物的檢測與統(tǒng)計分析

SSR和SRAP的擴增產(chǎn)物檢測均采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，進樣量為1 μL，在Tris-硼酸緩沖液（TBE）中以110 V恒壓電泳約2.5 h，銀染檢測，用掃描儀掃描電泳圖譜并保存圖像文件。

根據(jù)擴增后的電泳圖譜，在相同遷移位點上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，生成原始數(shù)據(jù)矩陣，采用公式[20]計算各材料間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。根據(jù)BOTSTEIN等[21]報道的方法計算多態(tài)性信息含量（polymorphism information content,PIC）值。利用NTSYS-pc 2.10軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計算出各品種間的遺傳相似系數(shù)，以非加權(quán)成對算術(shù)平均法（UPGMA）對材料進行聚類作圖，并用Excel 2010檢測這2種標記的遺傳相似系數(shù)的相關(guān)性，以比較基于這2種標記分析所得結(jié)果的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及擴增多態(tài)性

2.1.1 SSR引物篩選及擴增多態(tài)性

經(jīng)梯度PCR測試，確定了各引物的適宜退火溫度；在所測試的38對SSR引物中，33對有擴增產(chǎn)物，其中30對SSR引物產(chǎn)物的擴增條帶清晰，可用于對43份草莓材料的分析。如表2所示：30個SSR標記的擴增條帶數(shù)在2～17條之間，多態(tài)性條帶數(shù)為1～16條；試驗共擴增出233個條帶，平均每對引物7.77個條帶；多態(tài)性位點193個，平均多態(tài)性位點數(shù)6.43個；43份材料所揭示的等位基因型數(shù)在2～29之間；平均PIC值達到0.628 4，其中以SB31的PIC值（0.045 4）最低，以SB23的PIC值（0.955 1）最高。

2.1.2 SRAP引物篩選及擴增多態(tài)性

根據(jù)初步測試結(jié)果，結(jié)合以往利用SRAP對其他園藝植物的擴增效果，選擇了20個擴增產(chǎn)物條帶較為清晰的SRAP引物組合對43份草莓材料進行了測試。如表3所示：不同SRAP標記的擴增條帶數(shù)在8～22條之間，多態(tài)性條帶數(shù)為7～20條；共擴增出324條帶，平均每對引物16.20條；多態(tài)性位點286個，平均多態(tài)性位點數(shù)為14.30個；在43份材料中所揭示的等位基因型數(shù)在12～43之間；PIC值在0.708 6～0.976 7之間，20個標記的平均PIC值高達0.911 4，多態(tài)性明顯高于所用的SSR標記。

表2 不同SSR標記的多態(tài)性Table 2 Polymorphism of different SSR markers

2.2 聚類分析

2.2.1 SSR標記的聚類分析

利用SSR標記數(shù)據(jù)對供試草莓品種的遺傳相似系數(shù)計算表明，各材料間的相似系數(shù)在0.536～0.974之間，平均值為0.788。遺傳相似系數(shù)較低，說明其遺傳多樣性相對豐富。根據(jù)已知系譜，晶瑤（5）與紅頰（6）品種都是幸香（2）和章姬（1）品種的雜交后代，在本研究中達到了最高相似系數(shù)（0.974）。而紅玉（3）品種是以紅頰（6）品種為母本，再回交后選育而成的，因此與這2個品種的相似系數(shù)也較高，平均為0.957。野生白袍（16）、野生白草莓（17）和蘆根（18）是野生草莓，因此與其他材料的差異較大，相似系數(shù)（0.624）小于總體平均相似系數(shù)。

43份材料的SSR標記聚類結(jié)果見圖1。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.805時，可將43份種質(zhì)資源分為7大類群，包括5個復(fù)合組和2個獨立組。桃熏（15）和蘆根（18）各自聚為1支。復(fù)合組1和2包括日本品種和以日本品種為親本的雜交種；復(fù)合組3是2個白草莓品種；復(fù)合組4主要是一些歐美品種，包括日中性品種；復(fù)合組5是2個野生品種。

2.2.2 SRAP標記的聚類分析

43份材料的SRAP標記聚類結(jié)果見圖2。根據(jù)SRAP標記數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，不同材料間的相似系數(shù)在0.551～0.923之間，平均值為0.771，顯示的遺傳多樣性比SSR標記更為豐富。幸香（2）與紅玉（3）之間的遺傳相似度最高（0.923），野生白草莓（17）與法國1號（27）之間的遺傳差異最大，相似系數(shù)僅為0.551。與SSR標記分析結(jié)果一樣，野生白袍（16）、野生白草莓（17）和蘆根（18）與其他材料的差異較大，相似系數(shù)（0.616）小于總體平均相似系數(shù)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.783時，可將43份種質(zhì)資源分為7大類群，包括3個復(fù)合組和4個獨立組。點雪（19）、甜查理（8）、法國1號（27）、蘆根（18）各自聚為1支。復(fù)合組1主要以日本品種和以日本品種為親本的雜交種為主，但同時包括了十倍體桃熏（15）；復(fù)合組2主要是歐美品種和以其為親本的雜交種，也包括日中性品種；復(fù)合組3是2個野生品種。

表3 不同SRAP標記的多態(tài)性Table 3 Polymorphism of different SRAP markers

圖1 43個草莓品種的SSR標記聚類圖Fig.1 Dendrogram of 43 strawberry cultivars based on SSR markers

2.2.3 SSR和SRAP聯(lián)合標記的聚類分析

對43份材料進行SSR-SRAP聯(lián)合標記的聚類結(jié)果見圖3。將SSR和SRAP數(shù)據(jù)整合后，各材料間的相似系數(shù)在0.577～0.932之間，平均值為0.778，晶瑤（5）與紅頰（6）之間的遺傳相似度最高，相似系數(shù)達到0.932。3個野生品種與其他材料的差異較大，相似系數(shù)（0.691）小于總體平均相似系數(shù)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.798時，可將43份種質(zhì)資源分為7大類群，包括4個復(fù)合組和3個獨立組。桃熏（15）、甜查理（8）、蘆根（18）各自聚為1支。復(fù)合組1主要包括日本品種和以日本品種為母本的雜交種；復(fù)合組2主要是歐美品種和以其為親本的雜交種；復(fù)合組3是4個日中性品種；復(fù)合組4是2個野生品種。

2.2.4 SSR和SRAP標記的遺傳分析比較

對這2種標記的聚類結(jié)果進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，基于SSR標記的聚類結(jié)果與基于SRAP標記的聚類結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.817。而SSR標記、SRAP標記分別與SSR+SRAP聯(lián)合標記的相關(guān)系數(shù)為0.938和0.966，都達到極顯著水平。從最大相似系數(shù)來看，SSR+SRAP聯(lián)合標記與SSR標記的結(jié)果一致，即晶瑤（5）與紅頰（6）之間的相似系數(shù)最大。從聚類結(jié)果來看，SSR+SRAP聯(lián)合標記與SRAP標記或者SSR標記的聚類結(jié)果都有相似之處，是2種標記分析結(jié)果的綜合。與單獨種類的標記聚類結(jié)果相比，2種標記整合后的聚類分析結(jié)果（圖3）與草莓已知系譜[2]的吻合度更高，更能反映品種間的系譜關(guān)系。

3 討論

3.1 SSR和SRAP標記的比較

圖2 43個草莓品種的SRAP標記聚類圖Fig.2 Dendrogram of 43 strawberry cultivars based on SRAP markers

圖3 43個草莓品種的SSR和SRAP標記聚類圖Fig.3 Dendrogram of 43 strawberry cultivars based on SSR+SRAP markers

本研究首次采用SSR和SRAP標記相結(jié)合的方式對草莓種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行分析。對43份草莓分析的結(jié)果顯示，在平均多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)率、基因型數(shù)及PIC值等多態(tài)性參數(shù)上，SRAP均高于SSR。這一方面說明用SRAP標記比SSR標記更容易獲得大量的多態(tài)性條帶，這種趨勢在油菜[22-23]、馬鈴薯[24]、柑橘[25]、苦荬菜[26]、苦瓜[27]等作物的資源分析上已經(jīng)得到了證實，但不同報道中SRAP標記的多態(tài)性參數(shù)存在差異，這主要是所用物種及品種間的遺傳背景不同造成的；另一方面也表明SRAP在揭示不同材料遺傳多樣性方面的性能要優(yōu)于SSR。2種標記間產(chǎn)生的多態(tài)性差異與它們對基因組進行擴增時引物結(jié)合位置的不同有直接的關(guān)系，也可能與所用材料有關(guān)。SRAP引物是根據(jù)基因外顯子和內(nèi)含子中堿基組成的特點設(shè)計，對全基因組表達基因進行擴增，在不同個體和種間因為內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[28]，而SSR標記的多態(tài)性是由基因組DNA復(fù)制時的滑動和錯配等引起的重復(fù)序列變化而產(chǎn)生的，檢測的是基因組中局部重復(fù)基元的變異，因此所揭示的等位基因的變異數(shù)要少于SRAP標記。

鳳梨草莓本身遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，本研究所用材料有30個日本或國內(nèi)選育品種的親本，重合率非常高，另外也包含了4個法國品種、6個美國品種和3個野生品種，但這2種標記均能揭示出草莓不同材料間的豐富遺傳變異?？梢哉J為，這2種標記均適用于草莓的遺傳多樣性分析，而且非常適合對大量種質(zhì)的遺傳變異進行檢測。SSR和SRAP標記的遺傳相似系數(shù)矩陣達到顯著相關(guān)，相關(guān)性（r＝0.817）遠大于這2種標記在油菜[22]、馬鈴薯[24]、苧麻[29]中的相關(guān)性，可能與本研究中草莓材料的遺傳背景比較相似有關(guān)。SRAP標記與SSR+SRAP聯(lián)合標記的相關(guān)系數(shù)（0.966）高于SSR標記與SSR+SRAP聯(lián)合標記的相關(guān)系數(shù)（0.938），都達到顯著水平。因此，基于SRAP標記得出的結(jié)果比基于SSR標記的結(jié)果更接近基于聯(lián)合標記的結(jié)果，說明SRAP在揭示不同品種遺傳多樣性方面其性能要優(yōu)于SSR。這可能因為SSR與SRAP標記揭示基因組位置不同，也可能與本實驗中SRAP標記擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)目更多有關(guān)。從聚類結(jié)果來看，整合后的聚類分析能更全面、客觀、有效地揭示草莓種質(zhì)之間的遺傳多樣性。

3.2 SSR和SRAP在分析草莓遺傳多樣性中的應(yīng)用

雜交選育是我國草莓育種的主要途徑，占我國草莓品種育成的88.0%。綜合性狀優(yōu)良且差異較大的品種是選育優(yōu)質(zhì)抗病草莓品種的最好親本，紅頰和甜查理因此成為衍生品種數(shù)最多、遺傳貢獻值最大的2個品種[2]。目前，草莓分子標記在遺傳多樣性研究上的應(yīng)用主要體現(xiàn)在品種鑒定和種群進化與基因組結(jié)構(gòu)分析2個方面，在遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀位點（QTL）定位結(jié)合測序方面還與其他果樹具有較大差距[1]。

SRAP標記主要揭示與表達基因相關(guān)的信息，是油菜上通過鑒定親本遺傳多態(tài)性預(yù)測雜種優(yōu)勢的有效分子標記手段，效果要顯著優(yōu)于SSR標記[23]。而SSR標記更多地反映了全基因組的遺傳豐富度，同時對于以遠緣雜交等方式滲入的其他物種基因片段具有較好的檢測能力，有利于遺傳多樣性的保存。SSR標記與形態(tài)學(xué)相結(jié)合可以鑒定五葉草莓或綠色草莓與鳳梨草莓種間雜交F1代[30-31]，王壯偉等也利用4對SSR引物區(qū)分了親緣關(guān)系較近的29個歐美品種[32]，黃志城等利用20對SSR引物構(gòu)建了96份草莓品種的DNA指紋圖譜[33]。因此，SSR標記與SRAP標記的組合應(yīng)用，既能保存遺傳多樣性，又能較好地利用雜種優(yōu)勢，有利于草莓的中長期育種?？傊?，SSR標記與SRAP標記的組合應(yīng)用，同時綜合應(yīng)用測序、單核苷酸多態(tài)性（SNP）芯片、全基因組關(guān)聯(lián)分析等手段，有利于高密度遺傳圖譜的構(gòu)建，進行廣泛的性狀連鎖分析和基因挖掘，提高分子育種的精確度，推動草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究篩選出30對SSR引物和20對SRAP引物組合用于43個草莓品種的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，SRAP標記比SSR標記可獲得更多的多態(tài)性條帶。2種標記都在一定水平將歐美系草莓品種和日本系草莓品種各聚為一類，而2種標記整合后的聚類分析結(jié)果更能真實地反映草莓的已知系譜關(guān)系。本試驗研究結(jié)果可作為鑒定草莓品種的科學(xué)依據(jù)，為中國草莓新品種選育等方面的研究奠定基礎(chǔ)。