他克莫司通過穩(wěn)定CD2AP表達治療腎病腎小球硬化的分子機制

于生友?任琪?于力

【摘要】目的 探討他克莫司治療腎病腎小球硬化的分子機制，以及其對足細胞相關(guān)分子CD2相關(guān)蛋白（CD2AP） 表達的影響。方法 選取30只SD大鼠，隨機分為正常對照組（Con組）、嘌呤霉素氨基核苷（PAN） 腎病模型組（PAN組） 以及他克莫司組（FK組），每組10只。除Con組，其余2組均給予一次性腹腔注射PAN制備腎病腎小球硬化模型，模型制備成功后，F(xiàn)K組予他克莫司 0.5 mg/（kg·d）灌胃。給藥10 d后檢測3組大鼠尿蛋白及血生化指標，收集3組大鼠腎臟組織，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織染色的病理形態(tài)學(xué)改變，并使用蛋白免疫印跡法檢測3組腎臟組織CD2AP的相對表達量。結(jié)果 成功制造腎病腎小球硬化模型，與Con組比較，PAN組、FK組大鼠均出現(xiàn)大量蛋白尿且血清白蛋白、總膽固醇升高（P均< 0.05）。與PAN組相比，F(xiàn)K組的尿蛋白定量、血清白蛋白及總膽固醇均有所降低（P均< 0.05）。Con組腎小球及腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，毛細血管無淤血，腎小管腔內(nèi)未見管型。PAN組大鼠腎臟可見腎小球毛細血管袢的管腔閉塞、基質(zhì)增多以及球囊粘連，部分腎小球可見節(jié)段性硬化。FK組大鼠腎臟病理改變輕于PAN組。Con組、PAN組、FK組的腎臟組織CD2AP蛋白的相對表達量分別為1.46±0.31、0.72±0.15、1.04±0.23，其中PAN組低于Con組、FK組高于PAN組（P均< 0.05）。結(jié)論 CD2AP在PAN腎病大鼠腎臟組織的表達減弱，他克莫司可有效穩(wěn)定腎臟組織CD2AP的表達，減輕腎損傷程度。

【關(guān)鍵詞】他克莫司;嘌呤霉素氨基核苷;腎小球硬化;CD2相關(guān)蛋白

Molecular mechanism of tacrolimus in treatment of glomerulosclerosis by stabilizing CD2AP expression Yu Shengyou， Ren Qi， Yu Li. Department of Pediatric， Guangzhou First Peoples Hospital， Guangzhou 510180， China

【Abstract】Objective To investigate the molecular mechanism of tacrolimus in the treatment of glomerulosclerosis and evaluate the effect on the expression level of CD2-associated protein （CD2AP）. Methods Thirty SD rats were randomly and evenly divided into the control group （Con group）， puromycin aminonucleoside group （PAN group） and tacrolimus group （FK group）， respectively. Except the control group， the rats in the remaining two groups were given with intraperitoneal injection of purine aminonucleoside （PAN） to establish the rat models with glomerulosclerosis. After the model was successfully established， intragastric administration of tacrolimus at a dose of 0.5 mg/（kg·d） was given in the tacrolimus group. At 10 d after drug administration， the urine protein and routine blood biochemical parameters of all rats were detected in three groups and the renal tissues were collected and prepared for pathological staining under an optical microscope. The relative expression of CD2AP in the renal tissues was quantitatively measured by Western blot. Results The rat models with glomerulosclerosis were successfully established. Compared with the Con group， a large amount of proteinuria was observed and the expression levels of serum albumin and total cholesterol were significantly elevated in the PAN and FK groups （all P < 0.05）. Compared with the PAN group， the expression levels of urine albuminuria， serum albumin and total cholesterol were considerably decreased in the FK group （all P < 0.05）. In the Con group， the glomerulus and tubulointerstitial structures were normal， no blood congestion was noted in the capillaries and no tubules were found in the renal tubular lumen. In the PAN group， lumen occlusion， increased matrix and balloon adhesion of the glomerular capillary loop were observed， and segmental sclerosis was noted in partial glomeruli. The pathological changes of the kidney in the PAN group were more severe than those in the FK group. The relative expression levels of CD2AP protein in the kidney tissues were 1.46±0.31， 0.72±0.15 and 1.04±0.23 in the Con， PAN and FK groups， ?respectively. Statistical significance was observed between the PAN and Con groups， and between the FK and PAN groups （both P < 0.05）. Conclusions The expression of CD2AP is down-regulated in the renal tissues of rat models with puromycin-induced nephropathy. Tacrolimus can effectively stabilize the expression of CD2AP in the renal tissues and mitigate the severity of renal injury.

【Key words】Tacrolimus;Puromycin aminonucleoside;Glomerulosclerosis;CD2-associated protein

目前，國內(nèi)外研究證實局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）是多種致病因素長期損害腎小球所導(dǎo)致的微循環(huán)障礙，進而引起腎小球的缺血、缺氧，最終損傷腎小球毛細血管的內(nèi)皮細胞直至腎衰竭，但其具體的病因及發(fā)病機制尚不明確[1]。近年研究顯示，足細胞相關(guān)分子CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）與腎臟病以及蛋白尿的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，CD2AP表達與分布的異常與腎小球足細胞足突的消失、融合密切相關(guān)[2]。其具體機制尚不明確[3]。在一些遺傳性腎病綜合征的患兒和體外腎病動物模型中，當敲除腎小球足細胞CD2AP基因后，足細胞的足突發(fā)生改變、裂孔隔膜消失，進而導(dǎo)致大量蛋白尿的發(fā)生[4-5]。CD2AP在腎病腎小球硬化以及蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，本研究建立大鼠嘌呤霉素氨基核苷（PAN）腎病模型，并應(yīng)用免疫抑制藥他克莫司干預(yù)，探討他克莫司治療腎病腎小球硬化的分子機制，以及其對CD2AP表達的影響，為多靶點治療FSGS提供理論和實驗依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物

無特定病原（SPF）級雄性SD大鼠30只（購自中山大學(xué)實驗動物中心），體質(zhì)量（230±20）g，2～3月齡（相當于人類幼年至青年）。予自由飲食，SPF環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為3組：正常對照組（Con組）、PAN腎病模型組（PAN組），他克莫司組（FK組），每組各10只。本動物實驗經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有實驗操作均遵循實驗動物使用的相關(guān)倫理要求。

二、方 法

1. 模型制備

參照文獻[6]方法，PAN組、FK組大鼠均予一次性腹腔注射PAN（美國Sigma）15 mg/100 g 體質(zhì)量誘導(dǎo)腎病腎小球硬化模型，對照組給予一次性腹腔注射等量生理鹽水，至PAN注射后第10日，尿蛋白達到最高峰，血漿總蛋白和白蛋白明顯下降，血清總膽固醇和甘油三酯明顯升高，說明成功誘導(dǎo)了腎病模型。腎病模型制備成功后，F(xiàn)K組予他克莫司 0.5 mg/（kg·d）灌胃，每日1次;Con組、PAN組分別予等量生理鹽水灌胃，每日1次。

2. 檢查內(nèi)容

均在給藥10 d后以尾靜脈采血法收集各組大鼠的血液，同時收集器收集尿液。用焦酚紅方法測定24 h尿蛋白水平，用日立7600全自動生化分析儀檢測血液生化指標，包括白蛋白、總膽固醇、血尿素氮、血清肌酐。

3. 腎臟組織病理學(xué)檢測

采集血、尿樣本后以過量麻醉法（10%水合氯醛）安樂處死大鼠，然后迅速取出其腎臟組織，置于4%甲醛中固定，進行常規(guī)脫水、包埋以及切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織的病理學(xué)改變。

4. 腎臟組織CD2AP蛋白的表達檢測

收集上述各組大鼠的腎臟組織，采用蛋白免疫印跡法，用RIPA蛋白提取液（含蛋白酶抑制劑PMSF，申能博采生物科技有限公司）提取大鼠腎臟組織總蛋白，采用BCA蛋白質(zhì)定量法測定蛋白濃度。每孔加100 μg總蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉120 min，用兔抗CD2AP（美國 Sigma）為一抗4℃孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG室溫反應(yīng)60 min，使用LumiGLO發(fā)光液，膠片曝光、顯影、水漂洗、定影，掃描膠片結(jié)果導(dǎo)入電腦，分析目的蛋白條帶與CD2AP蛋白條帶的灰度值的比值作為其相對表達量。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 24.0進行分析，正態(tài)分布的定量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、3組大鼠的尿蛋白及血生化指標比較

本研究成功制造腎小球硬化腎病模型，與Con組比較，PAN組、FK組大鼠均出現(xiàn)大量蛋白尿，血總膽固醇、血尿素氮升高（P均< 0.05）。與PAN組相比，F(xiàn)K組的24 h尿蛋白定量、血總膽固醇降低，血白蛋白升高（P均< 0.05）。FK組的血白蛋白、總膽固醇和血清肌酐與Con組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），見表1。

二、3組大鼠的腎臟病理比較

Con組大鼠腎小球及腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，毛細血管無淤血，腎小管腔內(nèi)未見管型。PAN組大鼠腎臟可見腎小球毛細血管袢的管腔閉塞、基質(zhì)增多以及球囊粘連，部分腎小球可見節(jié)段性硬化。FK組大鼠腎臟病理改變明顯輕于PAN組，主要表現(xiàn)為腎小球系膜細胞和細胞外基質(zhì)（ECM）增生，炎癥細胞浸潤，偶見腎小球硬化，見圖1。

三、3組大鼠腎臟組織CD2AP蛋白相對表達量比較

Con組、PAN組、FK組的腎臟組織CD2AP蛋白的相對表達量分別為1.46±0.31、0.72±0.15、1.04±0.23，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 24.361，P < 0.001），其中PAN組低于Con組、FK組高于PAN組（P均< 0.05），見圖2。

討論

腎小球硬化是多種慢性腎臟疾病長期作用的結(jié)果，也是多種腎病進展至終末期的主要病理基礎(chǔ)之一，其主要的病理改變是大量ECM積聚。近年研究顯示，腎小球足突細胞裂孔膜上的分子如CD2AP、TRPC6等與腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究并證實這些足細胞相關(guān)分子在腎病蛋白尿的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要作用。目前國外研究已經(jīng)證實足細胞相關(guān)分子CD2AP與腎臟腎小球濾過屏障的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)完全敲除CD2AP等位基因（CD2AP-/-）的小鼠會出現(xiàn)先天性腎病綜合征[7]。進一步研究顯示，在CD2AP+/-基因敲除小鼠和FSGS患者中，基因突變檢測結(jié)果證實CD2AP在FSGS的發(fā)病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]。CD2AP是一種主要表達于腎小球足突細胞的胞漿蛋白，Nakatsue等（2005年）的研究顯示，足細胞CD2AP分子在PAN腎病大鼠模型中的表達降低。近來研究發(fā)現(xiàn)，高血壓腎臟纖維化患者的腎小球足細胞密度與足細胞相關(guān)蛋白的表達、腎功能、腎纖維化程度有關(guān)[9-10]。以上研究均提示足細胞相關(guān)分子CD2AP是維持正常腎小球生理功能的重要成分之一。

腎小球足細胞是腎臟的固有細胞，其損傷以后難以修復(fù)，也是導(dǎo)致腎病蛋白尿、腎小球硬化以及腎衰竭的重要原因之一[11-13]。臨床上通過多靶點治療可改變腎小球濾過膜分子結(jié)構(gòu)而達到治愈或減輕蛋白尿的目的，延緩腎病腎小球硬化的進程。他克莫司是通過干擾鈣依賴性信號傳導(dǎo)途徑的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，其主要抑制T淋巴細胞的增殖[14]。他克莫司還可通過直接抑制由足細胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶過度活化介導(dǎo)的細胞骨架分子蛋白synaptopodin的去磷酸化來穩(wěn)定細胞骨架，進而促進足細胞的修復(fù)[15]。本研究通過制備PAN腎病大鼠模型研究他克莫司治療腎病腎小球硬化的分子機制，結(jié)果顯示給予他克莫司干預(yù)后，PAN腎病大鼠的尿蛋白定量下降，病理改變輕于PAN組。此外，F(xiàn)K組CD2AP蛋白表達較PAN組增強，提示應(yīng)用他克莫司治療腎病腎小球硬化，同時可穩(wěn)定CD2AP分子的蛋白表達。

目前，F(xiàn)SGS的療效欠佳、病情易反復(fù)，是臨床治療難點。本研究顯示，足細胞相關(guān)分子CD2AP在PAN腎病大鼠中的表達下調(diào)，由此推測足細胞分子屏障改變可能是腎小球足細胞損傷的重要指標之一，是臨床腎病發(fā)生大量蛋白尿的因素之一。他克莫司可能通過穩(wěn)定足細胞裂孔隔膜分子的結(jié)構(gòu)和功能的完整性減輕腎小球硬化及蛋白尿，并可能通過阻斷或修復(fù)CD2AP信號傳導(dǎo)通路，達到治療蛋白尿的目的。

參 ?考 ?文 ?獻

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（收稿日期：2019-03-29）

（本文編輯：林燕薇）