單純性肥胖兒童體循環(huán)miRNA表達變化及相關(guān)性分析

劉祖霖?侯樂樂?孟哲?張麗娜? 江轉(zhuǎn)南?梁立陽

【摘要】目的 了解單純性肥胖兒童體循環(huán)微小RNA（miRNA）表達變化的特點，分析其與肥胖相關(guān)指標的關(guān)系。方法 選取8 ～ 10歲單純性肥胖兒童18例設(shè)為肥胖組，年齡分布、性別組成比例一致的正常體質(zhì)量兒童18名設(shè)為正常對照組，測量體格數(shù)據(jù)及生化指標。2組均隨機選取3例個體行miRNA基因芯片檢測，篩選差異性miRNA，剩余15例行miRNA驗證，并分析差異性miRNA表達量與體格數(shù)據(jù)、生化指標的相關(guān)性。結(jié)果 基因芯片篩選出表達差異的miRNA 67個，通過靶基因預測挑選miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-133b、miRNA-486-3p進行驗證。肥胖兒童體循環(huán)中miRNA-142-5p表達上調(diào)，且表達量與體質(zhì)量、腰圍、腰圍/身高、BMI、血壓、甘油三酯、總膽固醇、非HDL呈正相關(guān)，與胰島素敏感指數(shù)（ISI）呈負相關(guān)（P均 < 0.05）。miR-133b表達下調(diào)，且表達量與體質(zhì)量、腰圍、腰圍/身高、BMI等指標呈負相關(guān)，與ISI呈正相關(guān)（P均 < 0.05）。結(jié)論 單純性肥胖兒童體循環(huán)中miRNA的表達譜與正常兒童存在差異，且與代謝異常相關(guān);miRNA有望成為篩查肥胖兒童、代謝綜合征易患人群的分子標志物。

【關(guān)鍵詞】兒童;單純性肥胖; 微小核糖核酸

Changes in expression of circulating miRNAs and correlation with obesity-related parameters in children with simple obesity Liu Zulin， Hou Lele， Meng Zhe， Zhang Lina， Jiang Zhuannan， Liang Liyang. Department of Pediatrics， Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Liang Liyang， E-mail： doctorlly@ 126. com

【Abstract】Objective To investigate the changes of the expression of circulating microRNAs （miRNA） in children with simple obesity， and explore the correlation with obesity-related parameters. Methods Eighteen children with simple obesity， aged 8-10 years old， were assigned into the obesity group and 18 age-and gender-matched healthy children were enrolled in the control group. Morphometric data and biochemical parameters were quantitatively measured. In both groups， 3 chidlren were randomly selected for miRNA array to screen differential miRNA. The remaining 15 cases were subject to miRNA verification. The correlation between the expression levels of differential miRNA， and morphometric data and biochemical parameters was analyzed.? Results A total of 67 differential miRNAs were screened. Through prediction of target genes， miRNA-142-3p， miRNA-142-5p， miRNA-133b and miRNA-486-3p were selected for miRNA verification. The expression of miRNA-142-5p was up-regulated in children with simple obesity， which was positively correlated with body weight， waist circumference， waist-to-height ratio， body mass index （BMI）， blood pressure， triglyceride， total cholesterol， non-high density lipoprotein， whereas negatively correlated with insulin sensitivity index （ISI） （all P < 0.05）. The expression level of miRNA-133b was down-regulated， which was negatively correlated with body weight， waist circumference， waist-to-height ratio and BMI， whereas positively correlated with ISI （all P < 0.05）. Conclusions The expression profile of circulating miRNA differs between children with simple obesity and healthy counterparts， which is associated with metabolic disorders. Hence， miRNA might serve as a molecular marker for screening of children with obesity and high-risk metabolic disorders.

【Key words】Child;Simple obesity;microRNAs

微小RNA（miRNA）是指廣泛存在于真核生物體內(nèi)的一組具有調(diào)控mRNA表達功能、長約19 ～ 25核苷酸（nt）的小分子非編碼RNA，其與靶基因以堿基互補配對方式形成沉默復合體，發(fā)揮影響mRNA穩(wěn)定性、抑制mRNA翻譯并促進其降解的作用，具有時序性、組織特異性等生物學特性[1]。近年有研究顯示miRNA在脂肪細胞分化、糖脂代謝、胰島素信號通路等代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[2] 。然而筆者查閱文獻發(fā)現(xiàn)目前世界范圍內(nèi)關(guān)于單純性肥胖兒童體循環(huán)中miRNA表達變化的研究不多，且多處于統(tǒng)計描述階段;另外肥胖兒童體循環(huán)中miRNA表達水平與體質(zhì)量、腰圍、BMI等體格測量數(shù)據(jù)及血脂、血糖、胰島素等生化指標關(guān)系的分析缺乏大樣本的數(shù)據(jù)支持。因此，本課題組擬以健康兒童的外周血樣本為參考，對單純性肥胖兒童體循環(huán)miRNA水平進行分析，以進一步探究miRNA作為兒童肥胖相關(guān)代謝異常的分子標志物的可能性。

對象與方法

一、研究對象

選取2011年8月至2017年4月于我院新確診且未進行干預的8 ～ 10歲的單純性肥胖兒童18例（男7例、女11例）設(shè)為肥胖組（單純性肥胖指BMI大于同年齡、同性別第95百分位數(shù)，且除外繼發(fā)性肥胖），將同期到我院進行入學體檢的性別、年齡相匹配的正常兒童18名（男9名、女9名）設(shè)為正常對照組。分別隨機抽取單純性肥胖與正常兒童各3例，將其血樣用于基因芯片篩查（miRNA初篩），各組其余15例血樣用于miRNA驗證。所有入選對象均排除繼發(fā)性肥胖、自身免疫性疾病、家族遺傳性疾病、血液病、各種惡性腫瘤及近期有嚴重感染、重大外傷或手術(shù)等情況。

二、方 法

1. 人體參數(shù)測量

按照WHO兒童身高體質(zhì)量測量方法2003標準測量所有兒童的身高、體質(zhì)量、腰圍[3]。使用水銀血壓計測量所有兒童的血壓，根據(jù)兒童上臂長度選擇適當袖帶，每例測量2次，取平均值。

2. 生化指標檢測

于空腹8 h后采集所有兒童的靜脈血用于檢測。使用雅培安妥超越型血糖儀測定血糖，采用的是葡萄糖氧化酶電極測量法。使用日立7600全自動生化分析儀以直接化學發(fā)光免疫分析法測定總膽固醇、HDL、非HDL（non-HDL）、LDL、甘油三酯、胰島素。

3. 基因芯片檢測及逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）驗證

本部分研究委托廣州金域檢驗公司完成?；蛐酒捎酶咄縨icroRNA microarray技術(shù)，使用μParaflo 微流體芯片，miRNA的標記與芯片的雜交使用Cy3染料染色。雜交圖像利用激光掃描儀（GenePix 4000B，Molecular Device）采集，并使用Array-Pro 圖像分析軟件（Media Cybernetics）進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。驗證使用實時熒光PCR儀（Bio-Rad CFX96）完成。

4. 目標miRNA選擇方法

使用生物信息學分析軟件對篩選出的表達差異倍數(shù)較高的miRNA進行靶基因預測，挑選目標miRNA進行驗證。使用的生物信息學分析軟件包括：第一代預測軟件miRanda、TargetScans，第二代測序軟件PicTar、microTar以及數(shù)據(jù)庫miRBase。采用5種軟件分別進行靶基因預測，后取交集。靶基因參與糖脂代謝、胰島素信號通路或脂肪細胞分化等過程，即可作為目標miRNA。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布定量資料采用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）描述，組間比較采用秩和檢驗。2組定性數(shù)據(jù)的比較采用Fisher確切概率法。各指標間相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、 基因芯片檢測及目標體循環(huán)miRNA選擇

本研究共檢測循環(huán)miRNA 1895個，篩選出存在統(tǒng)計學意義差異的miRNA 67個（差異2倍及以上），其中表達下調(diào)48個，表達上調(diào)19個，最大差異倍數(shù)9.02倍。通過靶基因預測，挑選miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-133b與miRNA-486-3p進行驗證，見表1。

二、RT-PCR驗證

miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-486-3p及miRNA-133b 男、女間比較差異無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見表2。肥胖組血漿中miRNA-142-5p表達上調(diào)，miRNA-133b表達下調(diào)，而miRNA-142-3p和miRNA-486-3p的表達水平2組間無差異（P均> 0.05），見表3。

三、體循環(huán)miRNA-142-3p、miRNA-142-5p、miRNA-486-3p及miRNA-133b代謝異常差異性分析

miRNA-142-3p表達水平僅在中心性肥胖兒童中升高，而不受代謝異常影響;miRNA-142-5p表達水平在合并有高甘油三酯血癥、胰島素抵抗（IR）等代謝異常的兒童中表達升高，而不受中心性肥胖、血壓異常的影響; miRNA-133b表達水平不受代謝異常的影響;miRNA-486-3p表達水平在中心性肥胖及IR兒童中升高，不受高甘油三酯血癥、高血壓、高non-HDL血癥等代謝異常的影響，見表4。

四、miRNA表達水平相關(guān)性分析

分析體格測量數(shù)據(jù)及生化指標與miRNA-142-5p、miRNA-142-3p、miRNA-133b、miRNA-486-3p的相關(guān)性，結(jié)果顯示miRNA-142-5p表達水平與體質(zhì)量、腰圍、腰圍/身高、BMI、血糖、血壓、甘油三酯、non-HDL、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）呈正相關(guān)，與胰島素敏感指數(shù)（ISI）呈負相關(guān);而與年齡、總膽固醇、HDL、LDL等無相關(guān)性;miRNA-133b表達量與體質(zhì)量、腰圍、腰圍/身高、BMI、胰島素、HOMA-IR等呈負相關(guān)，與ISI呈正相關(guān)，與年齡、血脂、血壓等無相關(guān)性;miRNA-142-3p表達水平與體格測量數(shù)據(jù)及生化指標均不存在相關(guān)性;miRNA-486-3p表達水平僅與血壓水平呈正相關(guān)，見表5。

表5? ? ? ?目標體循環(huán)miRNA表達水平的相關(guān)性分析

項 目 miRNA-

142-3p miRNA-

142-5p miRNA-

133b miRNA-

486-3p

年齡 -0.330 0.070 -0.067 -0.077

體質(zhì)量 -0.300 0.482a -0.487a 0.155

腰圍 -0.349 0.452a -0.493a 0.180

腰圍/身高 -0.285 0.490a -0.434a 0.170

BMI -0.272 0.534a -0.443a 0.169

血糖 -0.317 0.491a -0.296 -0.182

收縮壓 -0.251 0.486a -0.300 0.401a

舒張壓 0.198 0.460a -0.033 0.350

甘油三酯 -0.047 0.374a -0.199 -0.061

總膽固醇 -0.366a 0.322 -0.106 -0.120

HDL 0.030 -0.020 0.167 0.170

LDL -0.182 0.223 -0.108 -0.133

non-HDL 0.287 0.362a -0.199 -0.099

胰島素 -0.282 0.578a -0.458a 0.085

HOMA-IR -0.200 0.590a -0.437a 0.092

ISI 0.253 -0.565a 0.466a -0.273

注：a為秩相關(guān)系數(shù)經(jīng)檢驗P < 0.05

討論

miRNA作為基因表達調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，幾乎參與生物體全部生命活動，從細胞的分化、發(fā)育、凋亡到機體的免疫應答、病毒感染、神經(jīng)變性性疾病、腫瘤等，而且在脂肪細胞分化、糖脂代謝、胰島素信號通路等代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-9]。循環(huán)中miRNA的表達變化與機體的生理病理狀態(tài)有關(guān)，并具有組織和疾病特異性，可以作為疾病的生物學標志物[2]。眾多研究顯示肥胖者與正常體質(zhì)量者血漿中miRNA表達譜存在較大差異，并與體質(zhì)量、腰圍等指標存在明確的相關(guān)性，并且隨體質(zhì)量、BMI等指標的變化而改變，提示體循環(huán)miRNA可能是比血脂、胰島素、膽固醇等生化指標更能敏感預測肥胖及其并發(fā)癥的生物學標志物[2， 10-15]。

我們通過基因芯片初篩及RT-PCR驗證，最終發(fā)現(xiàn)4個目標miRNA在兒童循環(huán)中的表達水平不受性別差異的影響;與正常兒童相比，單純性肥胖兒童體循環(huán)中miRNA-142-5p表達上調(diào)，miRNA-133b表達下調(diào)，且其表達水平受代謝異常的影響，并與體格測量數(shù)據(jù)及生化指標存在明確相關(guān)性。

一、miRNA-142-5p、miRNA-133b與肥胖

miRNA-142-5p的靶基因包括ATP1B1和ACOX1， ATP1B1與Na+/K+ ATP酶的活性有關(guān)，參與調(diào)節(jié)胰島素分泌等生物過程[16]?；駻COX1編碼過氧化物酶酰基輔酶A氧化酶，通過影響脂肪酸β氧化，參與PPAR信號通路調(diào)節(jié)的方式來調(diào)節(jié)機體血脂、甘油三酯及酮體代謝等生物學過程[17]。本研究顯示與正常兒童相比，單純性肥胖兒童體循環(huán)中miRNA-142-5p表達上調(diào)，其在合并有高甘油三酯血癥、IR等代謝異常的兒童中表達升高，且其表達水平與體質(zhì)量、腰圍、腰圍/身高、BMI、血糖、血壓、甘油三酯、non-HDL、胰島素及HOMA-IR呈正相關(guān)，與ISI呈負相關(guān)。miRNA-133b的靶基因包括TBL1X，參與調(diào)控脂肪細胞Wnt信號通路及脂肪細胞的分化。Wnt信號通路的激活，可以影響下游靶基因產(chǎn)物的磷酸化作用，進而抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）等脂肪細胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，使細胞保持未分化狀態(tài)，從而抑制脂肪的形成[18]。本研究顯示miRNA-133b在單純性肥胖兒童體循環(huán)中的表達下調(diào)，表達量與體質(zhì)量、腰圍、腰圍/身高、BMI、胰島素、HOMA-IR等指標呈負相關(guān)，與ISI呈正相關(guān)。因此，我們初步認為miRNA-142-5p和miRNA-133b可能通過轉(zhuǎn)錄后水平啟動基因沉默機制參與肥胖相關(guān)的脂肪細胞異常分化、IR和脂質(zhì)代謝紊亂的形成，參與肥胖代謝綜合征的病理生理過程，是一種潛在的肥胖相關(guān)代謝異常的分子標志物。

二、miRNA-142-3p、miRNA-486-3p與肥胖

miRNA-142-3p靶基因包括OSBPL3和MAP4K3，其中OSBPL3為細胞內(nèi)脂質(zhì)受體氧類固醇結(jié)合蛋白（OSBP）家族的成員，參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運及膽固醇的結(jié)合等生物學過程。MAP4K3為絲裂原活化蛋白激酶家族成員，參與胰島素信號通路的調(diào)節(jié)。人蛋白激酶B2是miRNA-486-3p的靶基因之一，是磷酸肌醇依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的異構(gòu)體，主要富集于胰島素敏感組織中，參與胰島素信號通路的調(diào)節(jié)，對葡萄糖刺激性胰島素反應及脂肪酸的β氧化具有正性調(diào)控作用[19]。既往研究表明miRNA-142-3p與miRNA-486-3p在肥胖者或糖尿病患者體循環(huán)中的表達水平升高，且與肥胖者的脂肪量、BMI、腰圍、HOMA-IR等指標存在明確相關(guān)性[14-15， 20]。本研究顯示，與正常兒童相比，單純性肥胖兒童體循環(huán)miRNA-142-3p及miRNA-486-3p表達水平無明顯差異，并與代謝異常、體格測量數(shù)據(jù)及生化指標無關(guān)，這可能與本次研究的樣本量少有關(guān)，其在單純性肥胖兒童循環(huán)中的表達特點尚需要更大樣本量的研究闡述。

綜上所述，在單純性肥胖兒童體循環(huán)中miRNA-142-5p呈高表達，而miRNA-133b卻呈低表達，說明兩者可能參與了兒童肥胖代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的病理生理過程，然而其具體作用機制尚未明確。本研究顯示兩者表達水平與單純性肥胖兒童的體格測量數(shù)據(jù)、生化指標及代謝異常明顯相關(guān)，為探討miRNA-142-5p、miRNA-133b作為肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥生物學標志物的可能性奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-05-28）

（本文編輯：洪悅民）