TLR4沉默對高糖誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及機(jī)制

林雪波

【摘要】目的 探討Toll樣受體-4（TLR4）沉默對高糖誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及機(jī)制。方法 利用 siRNA 沉默MS-1細(xì)胞中TLR4的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測TLR4 mRNA的表達(dá)，CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖，比色法測定一氧化氮水平，ELISA檢測內(nèi)皮素-1水平，羥胺法檢測超氧化物歧化酶（SOD）活力，硫代巴比妥酸（TBA）法檢測丙二醛水平，蛋白免疫印跡法檢測TLR4、髓樣分化因子88（MyD88）和核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κBp65蛋白的表達(dá)。將高糖處理的細(xì)胞分為高糖組及siRNA處理組（再分為siRNA-TLR4組及NC-TLR4組）進(jìn)行上述指標(biāo)的比較。結(jié)果 與高糖組比較，siRNA-TLR4組TLR4 mRNA的相對表達(dá)水平降低，細(xì)胞的增殖能力受抑制（P均<0.05）。此外，與高糖組比較，siRNA-TLR4組一氧化氮水平、SOD活力升高，內(nèi)皮素-1、丙二醛水平下降（P均< 0.05）。與高糖組比較，siRNA-TLR4組TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白減少（P均< 0.05）。結(jié)論 沉默TLR4在MS-1細(xì)胞中的表達(dá)水平，減弱TLR4/NF-κB信號通路傳遞的炎癥水平，間接降低氧化應(yīng)激水平，從而改善高糖誘導(dǎo)的胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

【關(guān)鍵詞】Toll樣受體-4;高糖;胰島;微血管內(nèi)皮細(xì)胞

【Abstract】Objective To evaluate the effect and mechanism of TLR4 silencing on high glucose-induced islet microvascular endothelial cell injury.? Methods The expression of TLR4 in the MS-1 cells was silenced by siRNA. The expression of TLR4 mRNA was detected by qRT-PCR. The cell proliferation was measured by CCK-8 assay. The nitric oxode（NO） level was determined by colorimetry. The endothelin （ET）-1 level was measured by ELISA. The superoxide dismutase （SOD） activity was detected by hydroxylamine method. The malondialdehyde （MDA） level was detected by thiobarbituric acid （TBA） method. The expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κBp65 proteins were detected by Western blot. The cells treated with high glucose were divided into the high glucose and isRNA silencing groups （further divided into siRNA-TLR4 and NC-TLR4 groups）. Relevant parameters were statistically compared among different groups.? Results Compared with the high glucose group， the relative expression level of TLR4 mRNA was significantly down-regulated， and the proliferation ability of the cells was inhibited in the siRNA-TLR4 group （both P < 0.05）. In addition， compared with the high glucose group， the NO level and SOD activity were significantly increased， whereas the ET-1 and MDA levels were significantly decreased in the siRNA-TLR4 group （all P < 0.05）. Compared with the high glucose group， the expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κBp65 proteins were significantly down-regulated in the siRNA-TLR4 group （all P < 0.05）.? Conclusions Silencing the expression of TLR4 in the MS-1 cells attenuates the inflammatory levels of the TLR4/NF-κB signaling pathways and indirectly reduces the oxidative stress levels， thereby mitigating the high glucose-induced islet microvascular endothelial cell damage.

【Key words】Toll-like receptor-4;High glucose;Islet;Microvascular endothelial cell

胰島是高度血管化的人體器官，具有結(jié)構(gòu)獨(dú)特的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，與胰島內(nèi)分泌功能密切相關(guān)，能夠快速響應(yīng)葡萄糖和激素波動(dòng)，但也易受不利因素的刺激，使胰島的微血管完整性受損，并通過炎癥細(xì)胞黏附和遷移，導(dǎo)致胰島受到破壞[1]。有研究顯示，長期高糖水平極易增加活性氧自由基水平，激活蛋白激酶C和輔酶I氧化酶系統(tǒng)，誘發(fā)胰島微血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷[2]。Toll樣受體（TLR）為識別受體的家族成員，對炎癥信號通路的激活有重要的促進(jìn)作用，同時(shí)還參與了宿主的炎癥反應(yīng)[3]。TLR4作為該家族成員，參與了胰島細(xì)胞的慢性炎癥和代謝紊亂的發(fā)生和進(jìn)展[4]。但筆者見胰島微血管內(nèi)皮的相關(guān)研究較少。本研究重點(diǎn)討論TLR4沉默對高糖誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能的影響。

材料與方法

一、材料與試劑

小鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞系MS-1細(xì)胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，目錄號GNM20）;TLR4 Rat siRNA（Origene公司，美國）;Lipofectamine? 2000 （Invitrogen 公司，美國）;BeyoFast? SYBR Green qPCR Mix （2X， Low ROX） （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒（南京建成生物研究所）;超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛、一氧化氮、內(nèi)皮素-1（南京建成生物研究所）;一抗TLR4、髓樣分化因子88（MyD88）、核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κBp65，羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（博士德生物工程有限公司）。

二、儀 器

倒置熒光顯微鏡（Nikon Corp）;酶標(biāo)儀（美國，BioTek）;LightCycler? 96 全自動(dòng)熒光定量PCR儀[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]。

三、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MS-1細(xì)胞接種于含5.5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化、傳代。依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置5.5、15.0、25.0、35.0、45.0 mmol/L葡萄糖濃度進(jìn)行96孔板細(xì)胞培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞活力并最終選擇葡萄糖濃度45.0 mmol/L為實(shí)驗(yàn)高糖濃度。采用葡萄糖濃度分別為5.5 mmol/L （正常組）、45.0 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h。將45.0 mmol/L處理的細(xì)胞再分為：①高糖組，采用45.0 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);②siRNA處理組，棄去培養(yǎng)基后繼續(xù)加入無血清培養(yǎng)基。將lipofectamineTM 2000與無血清無雙抗的培養(yǎng)基（1∶50）混合，靜置5 min。將稀釋的lipofectamineTM 2000和TLR4 siRNA干擾序列（5- ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG -3，siRNA-TLR4組）、未干擾序列（5- UCACACGUCAU UGUAGUGUGU -3，NC-TLR4組）混合、混勻（前期研究設(shè)計(jì)了3個(gè)siRNA進(jìn)行比較，最終確定5- ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG -3效果最佳），繼續(xù)靜置20 min后加入預(yù)先采用無血清無雙抗的培養(yǎng)基饑餓1 h的6孔板細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后，改換含45.0 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2. 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

參照Trizol試劑說明書提取RNA，測定純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。TLR4（AF110133.1）上游引物：5- CTCTGGGGAGGCACATCTTC -3，下游引物：5- CCCAGGTGAGCTGTAGCATT -3，產(chǎn)物大小208 bp;內(nèi)參 GAPDH（NM_001289726.1）上游引物：5- CAGGTTGTCTCCTGCGACTT -3，下游引物：5- TATGGGGGTCTGGGATGGAA -3，產(chǎn)物大小282 bp。反應(yīng)體系為20 μl，其中Beyo FastTM SYBR Green qPCR Mix （2×）10 μl，上游（3 μM）和下游（3 μM）2 μl，cDNA 2μl，PCR級高純水6 μl。采用light cycleR 96 qRT-PCR儀，擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃2 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，60 ℃延伸 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct計(jì)算。

3. CCK-8細(xì)胞活力檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為1×104個(gè)/ml接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，參照上文設(shè)置各組，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入CCK-810 μl，培養(yǎng)2 h，各孔細(xì)胞在450 nm測定吸光度A值，空白對照組調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。4. siRNA對高糖損傷MS-1細(xì)胞內(nèi)皮功能及SOD、丙二醛水平的影響??取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為1×104個(gè)/ml細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，上文設(shè)置各組，培養(yǎng)48 h。收集上清液，3 000 rpm離心10 min 去除細(xì)胞碎片，取上清凍存?zhèn)溆?。用比色法測定一氧化氮水平，ELISA檢測內(nèi)皮素-1水平，羥胺法檢測SOD活力，硫代巴比妥酸（TBA）法檢測丙二醛水平。

5. 蛋白免疫印跡法檢測TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表達(dá)

常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，調(diào)整各樣本蛋白總量，參照說明書行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗于4℃孵育過夜，孵育二抗，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，以β-actin為內(nèi)參分析待測蛋白相對表達(dá)值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用表示，2組間比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。細(xì)胞活力的組間比較采用重復(fù)測量資料方差分析。α=0.05。

結(jié)果

一、高糖對MS-1細(xì)胞TLR4異常表達(dá)的影響

采用qRT-PCR檢測MS-1細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，正常組TLR4 mRNA的表達(dá)水平（0.47±0.03）低于高糖處理組（1.21±0.58） （t =2.207，P = 0.046）。

二、siRNA對MS-1細(xì)胞中的TLR4 mRNA表達(dá)的抑制作用

高糖組TLR4 mRNA的相對表達(dá)量為1.19 ±0.55，NC-TLR4組為1.16±0.49，siRNA-TL4組為0.45±0.04，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 3.230，P = 0.036）。與高糖組比較，siRNA-TL4組TLR4 mRNA的表達(dá)水平降低（LSD-t = 2.324，P = 0.040）。

三、siRNA對MS-1細(xì)胞活力的影響

重復(fù)測量資料方差分析顯示組別與時(shí)間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組別×?xí)r間=10.21，P=0.042），故分析單獨(dú)效應(yīng)。與高糖組相比，siRNA-TLR4組細(xì)胞活力增加（P < 0.05）。而高糖組細(xì)胞活力與NC-TLR4組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

四、siRNA對高糖損傷MS-1細(xì)胞內(nèi)皮功能及SOD、丙二醛水平的影響

與高糖組比較，siRNA-TLR4組一氧化氮水平、SOD活力升高（LSD-t值分別為3.674、11.286，P值分別為0.021、< 0.001）;與高糖組比較，siRNA-TLR4組內(nèi)皮素-1、丙二醛水平下降（LSD-t值分別為3.933、24.225，P值分別為0.017、< 0.001）。而高糖組與NC-TLR4組的一氧化氮、內(nèi)皮素-1、SOD和丙二醛比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t值分別為0.134、0.228、1.381、1.253，P值分別為0.900、0.831、0.278、0.239）。

五、MS-1細(xì)胞TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表達(dá)

與高糖組比較，siRNA-TLR4組TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白降低（LSD-t值分別為5.068、9.127、5.302，P值分別為0.007、< 0.001、0.006）。而高糖組與NC-TLR4組比較，TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LSD-t值分別為0.346、0.961、0.872，P值分別為0.746、0.391、0.412）。

討論

長期處于高血糖狀態(tài)可能降低β細(xì)胞活性的機(jī)制目前尚未完全明確，但可能涉及誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致胰島內(nèi)的促炎反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[5]。已有的研究重點(diǎn)在于改善高血糖從而調(diào)節(jié)胰島功能，而有關(guān)胰島微循環(huán)的研究很少。一些研究表明，高血糖容易導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基水平過高、脂質(zhì)過氧化有關(guān)，并會引起線粒體功能障礙，活化氧化應(yīng)激通路，加重組織損傷[6-7]。TLR4 屬于TLR家族蛋白，能通過激活TLR信號通路中的關(guān)鍵接頭分子MyD88傳遞上游信息并激活 NF-κB 等信號通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，在機(jī)體的早期免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色[8]。

研究證實(shí)，高血糖易誘發(fā)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的丙二醛，并損傷胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]。而SOD作為重要的抗氧化酶，能通過清除超氧陰離子自由基阻斷氧自由基對胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[10]。體內(nèi)一氧化氮主要通過一氧化氮合酶催化合成血管舒張因子，對免疫應(yīng)激等具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。內(nèi)皮素-1為一氧化氮的拮抗劑，可以維持血管基礎(chǔ)張力，對心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)揮重要作用[12]。因此，內(nèi)皮素-1和 一氧化氮水平失衡將影響血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能。在本研究中，高糖誘導(dǎo)的MS-1細(xì)胞的上清液中，丙二醛、內(nèi)皮素-1水平上升，而SOD、一氧化氮水平下降，提示MS-1細(xì)胞存在氧化應(yīng)激損傷。而通過siRNA沉默TLR4活性后，丙二醛、內(nèi)皮素-1水平下降，而SOD、一氧化氮水平上升，提示此時(shí)MS-1細(xì)胞抗氧化能力增加，能夠有效清除氧自由基，血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能恢復(fù)。已有研究顯示，TLR4能介導(dǎo)單核活性細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，而本研究顯示的siRNA沉默TLR4后氧化應(yīng)激水平的改變，可能與其有關(guān)，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

高水平的氧化應(yīng)激可以直接或間接激活TLR4/NF-κB信號通路級聯(lián)反應(yīng)，增加炎性因子表達(dá)水平，促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[13]。為了驗(yàn)證高糖所致的氧化應(yīng)激水平與TLR4/NF-κB信號通路的關(guān)系，在本研究中筆者選擇阻斷TLR4活性，因?yàn)槠錇檠装Y信號通路的受體，是炎癥信號級聯(lián)放大的關(guān)鍵。筆者采用高糖干預(yù)MS-1細(xì)胞，siRNA轉(zhuǎn)染MS-1細(xì)胞干擾TLR4的表達(dá)，并與未轉(zhuǎn)染的高糖組比較，結(jié)果顯示，TLR4沉默后，MyD88、NF-κBp65水平降低，與高糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明沉默TLR4活性，可以通過降低關(guān)鍵接頭分子MyD88水平，減弱傳遞到NF-κB的炎癥信號，從而抑制NF-κB的活化，阻斷TLR4/ MyD88/NF-κB信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低炎性因子的表達(dá)水平，有效調(diào)控該信號通路，保護(hù)胰島作用。

總之，siRNA沉默TLR4表達(dá)水平，減弱TLR4/NF-κB信號通路傳遞的炎癥程度，間接降低氧化應(yīng)激水平，從而改善高糖誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，為臨床糖尿病的治療提供新的靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Lu T， Zhou D， Gao P， Si L， Xu Q. Resveratrol attenuates high glucose-induced endothelial cell apoptosis via mediation of store-operated calcium entry. Mol Cell Biochem，2018，442（1-2）：73-80.

[2] 董靖，樂嶺，向光大，向林，劉敏，倪靜，王永，葉麗姿.津力達(dá)顆粒預(yù)處理對高糖誘導(dǎo)小鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響.微循環(huán)學(xué)雜志，2017，27（4）：6-11.

[3] Huang NQ， Jin H， Zhou SY，Shi JS，Jin F. TLR4 is a link between diabetes and Alzheimers disease. Behav Brain Res， 2017， 316：234-244.

[4] Lai JL， Liu YH， Liu C， Qi MP， Liu RN， Zhu XF， Zhou QG， Chen YY， Guo AZ， Hu CM. Indirubin Inhibits lps-induced inflammation via TLR4 abrogation mediated by the NF-κB and MAPK signaling pathways. Inflammation， 2017， 40（1）：1-12.

[5] 王依婷，趙夢鴿，盛雪萍，張健，蔣翠花，殷志琦.青錢柳三萜酸對高糖所致的胰島α細(xì)胞胰島素抵抗的影響.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，49（2）：215-221.

[6] 龐潔，梁俊清，王志鑫，魏聰，高懷林.津力達(dá)聯(lián)合通心絡(luò)對高糖誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷干預(yù)作用及機(jī)制研究.中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（3）：430-435.

[7] 林麗明，張美金，許昌聲，林金秀.維生素D通過抑制Pin1介導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激拮抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡.中國病理生理雜志，2018，34（1）：15-21.

[8] Ye HY， Jin J， Jin LW， Chen Y， Zhou ZH， Li ZY. Chlorogenic acid attenuates lipopolysaccharide-induced acute kidney injury by inhibiting TLR4/NF-κB signal pathway. Inflammation， 2017，40（2）：523-529.

[9] 張磊，孫娟，李偉.脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下胰島細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激水平的影響.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33（10）：1066-1069.

[10] Goc Z， Szaroma W， Kapusta E， Dziubek K. Protective effects of melatonin on the activity of SOD， CAT， GSH-Px and GSH content in organs of mice after administration of SNP.Chin J Physiol，2017，60（1）：1-10.

[11] 羅雪蘭，陳偉，莫國君，楊鵬，歐和生.miRNA-24對血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)/活性及其代謝產(chǎn)物NO生成的影響.國際藥學(xué)研究雜志，2017，44（3）：245-250.

[12] 秦漢，胡志希，李琳，呂佳，楊楊，張易.雪蓮?fù)}丸對冠心病氣虛血瘀證小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ET-1、NO、ACE的影響.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（2）：25-28.

[13] 宋艷，候夢琳，羅初凡，區(qū)景松，孫慧蘭，陸立鶴.氧化應(yīng)激通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB誘導(dǎo)血管鈣化.中國分子心臟病學(xué)雜志，2015，15（1）：1206-1209.

（收稿日期：2018-10-30）

（本文編輯：洪悅民）