肺細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠治療大鼠放射性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究*

吳鵬飛，施光清，范賢明，肖貞良，周菁

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸科，四川 瀘州 646000；2.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 呼吸科，四川 成都 610083）

放射性肺損傷是腫瘤放療中常見的并發(fā)癥，目前無有效治療手段[1-2]。其發(fā)生包括早期炎癥浸潤(rùn)及后期纖維化，抑制炎癥反應(yīng)是治療的關(guān)鍵[3]。

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是組織再生領(lǐng)域的一種新型材料，是離體器官經(jīng)過洗脫細(xì)胞、裂解脂膜后殘余的結(jié)構(gòu)和功能蛋白復(fù)合體，含有天然的胞外微環(huán)境，對(duì)細(xì)胞的增殖、調(diào)亡及免疫等生物學(xué)行為具有調(diào)節(jié)作用[4-7]。通過凍干、酶消化等將ECM制成溫敏性水凝膠，即室溫下為液體，37℃凝固為膠凍樣，可黏附于局部組織并持續(xù)發(fā)揮作用[6]。該特性使ECM可能成為一種治療藥物，目前關(guān)于ECM水凝膠治療肺部疾病的研究報(bào)道很少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠治療大鼠放射性肺損傷研究，初步探討其可行性及有效性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠（成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司）42只，6周齡，體重（220±20）g，24只用于氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠的安全性評(píng)估，18只用于觀察肺ECM水凝膠療效，常規(guī)飼養(yǎng)，12 h晝夜交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施過程操作符合動(dòng)物倫理。

1.1.2 儀器與材料直線加速器（美國(guó)Varian公司），冷凍切片機(jī)（英國(guó)珊頓公司），倒置相差熒光顯微鏡（日本Olympus公司），冷凍干燥機(jī)（北京盛超科創(chuàng)生物科技有效公司），冷凍研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。蘇木精及伊紅染液（北京索拉寶科技有限公司），生物素（美國(guó)Thermo公司），親和素（武漢博士德生物公司），大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 肺ECM的制備根據(jù)SONG等[7]的肺ECM制備過程，以10%水合氯醛麻醉大鼠，12 500 u肝素+250 ml生理鹽水全身灌流肝素化，18 G針行肺動(dòng)脈插管，結(jié)扎、固定，緊貼脊柱完整分離肺組織，依次予以0.1 % SDS（2 h）、純水（15 min）、1% Triton-X-100（30 min）及PBS（72 h）灌流。將所獲的肺ECM制成凍干粉劑，環(huán)氧乙烷消毒后，-80℃長(zhǎng)期保存。

1.2.2 肺ECM水凝膠的制備將10 mg/ml肺ECM粉末混入0.1 mol/L鹽酸-胃蛋白酶液（1 mg/ml）中，室溫?cái)嚢柘?8 h，用0.1 mol/L氫氧化鈉NaOH滴定至pH 7.4，10倍PBS稀釋至1倍，經(jīng)體外驗(yàn)證，該水凝膠在常溫下為液態(tài)，在37℃、30 min左右可凝結(jié)成膠凍狀[8]。

1.2.3 放射性肺損傷動(dòng)物模型的復(fù)制36只大鼠以10%水合氯醛麻醉后，仰臥位固定于木板上，充分暴露胸部。照射野上界為兩側(cè)腋窩中點(diǎn)的連線、下界為劍突下緣平面，其余部位用5 cm厚鉛板遮擋，予以6MV-X線直線加速器單次照射，劑量20 Gy，劑量率3.5 Gy/min，源皮距100 cm[9]。

1.2.4 動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)一：根據(jù)氣管內(nèi)注射劑量的不同（0、300、500及800μl），24只放射性肺損傷大鼠隨機(jī)分為0μl組、300μl組、500μl組及800μl組，每組6只。實(shí)驗(yàn)二：18只大鼠（12只放射性肺損傷大鼠+6只正常大鼠）隨機(jī)分為照射組（照射+氣道內(nèi)注射生理鹽水500μl）、ECM組（照射+氣道內(nèi)注射肺ECM水凝膠500μl）及對(duì)照組，每組6只。

1.2.5 肺ECM水凝膠治療將肺ECM水凝膠與事先配好的1 mg∶180μl純水稀釋的生物素按照93∶7的濃度混勻。照射30 min后，實(shí)驗(yàn)一的大鼠麻醉后固定于木板上，取仰臥位，頭抬高60°，頸部皮膚豎切口0.5 cm，逐層分離暴露氣管，環(huán)甲膜穿刺，用1 ml注射器分別緩慢注入300、500及800μl生物素標(biāo)記的肺ECM水凝膠；實(shí)驗(yàn)二大鼠注入500μl肺ECM水凝膠或等量生理鹽水。

1.2.6 動(dòng)脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）檢測(cè)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組觀察到肺ECM水凝膠在體內(nèi)約30 min成膠，因此在照射1 h后，實(shí)驗(yàn)一各組大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)PaO2變化。

1.2.7 肺組織病理學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二各組大鼠在照射7 d后取左肺，4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋及切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察肺組織病理改變。參考MIKAWA等[10]的評(píng)分方法評(píng)價(jià)肺損傷程度，包括：①肺泡充血；②肺泡水腫；③肺泡壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；④肺泡壁增厚。根據(jù)損傷程度分為：無損傷0分，每高倍鏡視野下?lián)p傷范圍＜25%計(jì)1分，25%～＜50%計(jì)2分，50%～＜75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分，每項(xiàng)最高4分，總分最高16分。

1.2.8 免疫熒光染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一300、500及800μl組大鼠照射1 h后取左肺，OCT冷凍切片包埋劑包埋后冷凍切片，PBS清洗3次，3 min/次、5%牛血清清蛋白封閉30 min，PBS清洗3次，3 min/次、親和素反應(yīng)30 min，PBS清洗3次，3 min/次，DAPI染色3 min，PBS清洗3次，3 min/次，抗熒光淬滅劑封片后觀察。

1.2.9 血清TNF-α、IL-6濃度檢測(cè)照射7 d后，實(shí)驗(yàn)二各組大鼠腹主動(dòng)脈取血3 ml，常溫靜置1 h，3 500 r/min離心15 min，取上清0.5 ml。血清TNF-α、IL-6含量檢測(cè)按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺ECM支架

離體肺組織顏色紅潤(rùn)，脫細(xì)胞液灌流后的肺ECM，肉眼觀察肺組織大體標(biāo)本變透明，HE染色未見藍(lán)染的細(xì)胞核成分，絕大多數(shù)已經(jīng)洗脫肺組織有核細(xì)胞成分。見圖1。

圖1 肺ECM支架

2.2 各組大鼠PaO2比較

實(shí)驗(yàn)一大鼠氣管注射肺ECM水凝膠后30 min內(nèi)，800μl組大鼠死亡3只，存活率為50%，0、300及500μl組無死亡，存活率均為100%。注射30 min后，0、300、500及800μl組大鼠PaO2分別為（84.51±7.78）、（81.96±9.97）、（79.29±7.56）和（61.51±8.39）mmHg，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.241，P=0.000）；0μl組與300μl組大鼠PaO2比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.951，P=0.345），0μl組與500μl組大鼠PaO2比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.947，P=0.055），300μl組與500μl組大鼠PaO2比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.996、P=0.323），300μl組與800μl組大鼠PaO2比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.629，P=0.000）。說明氣管注射肺ECM水凝膠300和500μl不會(huì)影響大鼠PaO2，而800μl則會(huì)影響大鼠PaO2。

2.3 各組大鼠肺泡內(nèi)ECM水凝膠的分布

300、500及800μl組能在肺泡表面觀察到綠色熒光。800μl組觀察到部分水凝膠在氣道內(nèi)滯留，300和500μl組未見氣道滯留，且前者比后者肺泡內(nèi)綠色熒光分布更均勻、廣泛。見圖2。

2.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察及評(píng)分比較

照射7 d后通過光鏡觀察，與對(duì)照組比較，照射組大鼠肺泡間隔充血水腫、增寬，細(xì)胞浸潤(rùn)增多，肺泡腔可見滲出，氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠后，上述病理改變減輕（見圖3）。照射7 d后，對(duì)照組、照射組及ECM組的肺組織病理評(píng)分分別為（0.90±0.31）（5.50±1.95）和（3.50±0.85）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.282、P=0.000）；照射組與對(duì)照組肺組織病理評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-7.336，P=0.000），ECM組與照射組肺組織病理評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.437，P=0.033）。說明氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠能減輕放射性肺損傷早期的病理改變。

圖2 大鼠肺泡中肺ECM水凝膠的分布情況 （免疫熒光染色×400）

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平變化

對(duì)照組、照射組和ECM組大鼠血清TNF-α分別為（57.11±9.11）、（98.79±12.12）和（74.49±20.17）pg/ml，對(duì)照組、照射組和ECM組大鼠血清IL-6分別為（35.14±4.25）、（75.67±9.22）和（53.49±8.40）pg/ml，各組大鼠血清TNF-α、IL-6比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.088和71.172，均P=0.000），照射組及ECM組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較對(duì)照組升高（P＜0.05），ECM組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較照射組降低（P＜0.05）。見圖4。

圖3 肺組織病理學(xué)觀察 （HE染色×200）

圖4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 （n =6，±s）

3 討論

ECM材料是近年來組織再生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，其免疫源性低，含有最天然的細(xì)胞外微環(huán)境，是種子細(xì)胞生長(zhǎng)的理想材料[11]。同時(shí)，含有大量活性因子，體外研究表明ECM對(duì)組織細(xì)胞的行為具有多項(xiàng)調(diào)節(jié)作用，因此可能在組織局部發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化及改善血管形成等多種生理作用[5，12]。近年來研究報(bào)道，將ECM制備成可注射的ECM水凝膠，局部注射后直接作用于受損組織表面，對(duì)受損腦、心肌及皮膚等有治療作用[4，12]。GHUMAN等[13]將豬膀胱ECM水凝膠注射到大鼠腦梗死區(qū)域，當(dāng)水凝膠濃度為8 mg/ml時(shí)，損傷區(qū)域宿主細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，其中60%為腦源性細(xì)胞，能顯著發(fā)揮內(nèi)源性修復(fù)作用。SUN等[14]發(fā)現(xiàn)碳納米管復(fù)合水凝膠能促進(jìn)心肌細(xì)胞閏盤形成，增強(qiáng)其與周圍心肌細(xì)胞的黏附作用。目前，ECM水凝膠應(yīng)用于肺損傷等相關(guān)疾病的研究很少。放射性肺損傷多發(fā)生在胸部腫瘤放療后或核輻射暴露后，是臨床治療的難點(diǎn)之一。如何減少細(xì)胞壞死，減輕炎癥反應(yīng)，成為其早期治療的關(guān)鍵[3]。既往研究表明，肺組織受照射后1 h內(nèi)即啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)[15]。本實(shí)驗(yàn)研究提示ECM水凝膠有抗炎作用，早期給藥減輕局部炎癥反應(yīng)，對(duì)放射性肺損傷產(chǎn)生治療作用。

本研究首先利用脫細(xì)胞方法[7]制備肺ECM支架，HE染色證實(shí)脫細(xì)胞效果滿意，然后按照WOLF等[8]和PRICE等[16]報(bào)道的方法將ECM支架制成溫敏性水凝膠。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將材料注射到大鼠皮下，觀察周圍炎癥反應(yīng)，HE染色未見局部出血或細(xì)胞滲出增多，組織相容性好。

實(shí)驗(yàn)時(shí)ECM水凝膠給藥量和給藥方式至關(guān)重要。一方面大鼠氣管直徑小，注射量過大存在窒息風(fēng)險(xiǎn)，肺ECM水凝膠在終末氣道分布過多，會(huì)影響肺組織氣體交換。另一方面，為確保給藥效果，應(yīng)使水凝膠充分、均勻地附著在肺泡表面。本研究采用環(huán)甲膜穿刺、氣管內(nèi)注射的精確給藥方式，結(jié)果顯示注射500μl肺ECM水凝膠后，水凝膠在肺泡表面均勻、充分分布，且不會(huì)造成大鼠死亡率上升，確定給藥方式和劑量安全有效。楊文等[17]在檢測(cè)KM小鼠氣管注射耐受量時(shí)發(fā)現(xiàn)，32 g左右的KM小鼠，氣管內(nèi)注射生理鹽水的劑量為3.814～4.768 ml/kg時(shí)，小鼠死亡率為40%～50%，比本實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍低，可能是由于ECM凝結(jié)成膠后較生理鹽水對(duì)通氣及換氣功能的影響更大。血清TNF-α、IL-6水平在放射性肺損傷早期就顯著升高，且與局部肺組織損傷程度相關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，早期氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠抑制血清TNF-α、IL-6的表達(dá)，降低大鼠局部肺組織損傷病理評(píng)分，初步顯示ECM水凝膠局部給藥有一定的療效和研究?jī)r(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)成功獲取了肺ECM水凝膠，復(fù)制氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠治療大鼠放射性肺損傷模型，并初步驗(yàn)證其對(duì)放射性肺損傷的療效。肺ECM水凝膠對(duì)放射性肺損傷的保護(hù)作用和機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，以明確其對(duì)肺水腫、肺組織細(xì)胞凋亡和肺部炎癥反應(yīng)等的干預(yù)作用。