牛支原體臨洮分離株NOX-1的克隆表達(dá)、酶學(xué)活性及其亞細(xì)胞定位研究

李 丹，張志雄，邢小勇，包世俊

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

牛支原體（Mycoplasma bovis，M. bovis）是?？苿?dòng)物的一種重要的致病性支原體[1]，感染后主要分布于牛呼吸道和乳腺組織中，可引起牛的角膜結(jié)膜炎、肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎以及生殖道損傷等多種疾病[2-3]。自1961年Hale首次從患乳腺炎的病牛乳汁中分離到M. bovis以來[3]，世界各地相繼報(bào)道了牛支原體感染相關(guān)疫情。目前，牛支原體感染呈世界性分布，包括歐美等許多養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家和地區(qū)。2008年我國(guó)首次從患有壞死性肺炎的肉牛中分離出支原體，確診為牛支原體肺炎[6]。目前，我國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)發(fā)生牛支原體肺炎疫情，給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶（NADH oxidase，NOX）在有O2存在的條件下，通過催化NADH生成NAD+。NOX可與以NAD+為輔酶的氧化還原酶偶聯(lián)，在催化氧化還原反應(yīng)的同時(shí)生成NADH，從而使輔酶能夠循環(huán)再生，產(chǎn)生提高催化反應(yīng)效率的效果。根據(jù)產(chǎn)物的不同，可將NOX分為兩類：一類為產(chǎn)H2O2型NADH氧化酶（NOX-1），另一類為產(chǎn)H2O型NADH氧化酶（NOX-2）[8-9]。1996年，Higuchi等[10]對(duì)變形鏈球菌（Streptococcus mutans）的NOX-2基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，并將其與糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）NOX-1基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)相似性小于20.4%。1999年Auzat 等[11]通過對(duì)肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）NOX的研究，首次發(fā)現(xiàn)了酶活性降低會(huì)導(dǎo)致病原微生物的適應(yīng)力及毒力下降。2016年研究人員對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia）NOX基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及結(jié)構(gòu)功能等相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)NOX蛋白與藍(lán)氏賈第鞭毛蟲致病性相關(guān)[12]。本研究采用PCR技術(shù)對(duì)牛支原體NOX-1基因進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而完成NOX-1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)，以及表達(dá)產(chǎn)物NOX-1在M.bovis內(nèi)的初步定位，以期為進(jìn)一步探索NOX的生物學(xué)功能以及M. bovis有關(guān)后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑牛支原體（M. bovis）臨洮株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；大腸桿菌（E. coli）DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物有限公司；表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒購(gòu)自Novagen公司；新西蘭白兔（Oryctolagus cuniculus）購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ、PrimerSTAR?Max DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA Marker購(gòu)自CWBio公司；Protein Marken、T4DNA Ligase購(gòu)自Thermo公司；TMB（四甲基聯(lián)苯胺）顯色試色液、DAB（二氨基聯(lián)苯胺）底物顯示液購(gòu)自Tiangen公司；Ni-NAT His Bind Purification Kit購(gòu)自Novagen公司；支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)購(gòu)自Hopebio公司；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司；馬血清購(gòu)自Mhbio公司；Triton X-114、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；羊抗兔HRP-IgG購(gòu)自Canlife公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BCA（二喹啉甲酸）蛋白定量試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Tiangen公司。

1.2 引物合成利用PrimerSelect軟件，參照GenBank中M.bovisHubei株NOX-1基因序列（GenBank 登錄號(hào)：NC_015725.1），并對(duì)序列中4個(gè)編碼色氨酸的密碼子TGA進(jìn)行優(yōu)化（表1）。

1.3 M. bovis基因組的提取將M.bovis臨洮株菌液按10%接種量轉(zhuǎn)接于牛支原體液體培養(yǎng)基，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)35 h，取1.5 mL菌液，9500×g離心10 min，用1×PBS洗滌2次，棄去上清后用100 μL雙蒸水（ddH2O）重懸沉淀，沸水浴10 min，冰浴5 min，8000×g離心10 min，上清液即為粗提的M.bovis基因組DNA。

1.4 NOX-1基因的PCR擴(kuò)增以粗提的M.bovis基因組DNA作為模板，采用PCR擴(kuò)增得到M.bovis臨洮株NOX-1基因。PCR反應(yīng)體系為40 μL：2×PrimerSTAR?Max DNA聚合酶20 μL，模板（M.bovis基因組）2 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）16 μL。樣品送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，PCR反應(yīng)條件見表2。

表1 NOX-1基因overlap PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of NOX-1 gene for overlap PCR amplification

表2 PCR擴(kuò)增條件Table 2 PCR amplification condition

1.5 序列分析應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)不同分離株的NOX-1基因序列進(jìn)行比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建將優(yōu)化后PCR產(chǎn)物與pET-28a (+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收產(chǎn)物于4℃過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布含有卡那霉素抗性的LB平板（1.0 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、1.0 g NaCl、1.1 g瓊脂粉溶于100 mL蒸餾水中，高溫滅菌后加入100 μg/μL卡那霉素75μL），于恒溫培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-NOX-1，并送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 pET-NOX-1原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化

1.7.1 pET-NOX-1原核表達(dá) 取重組表達(dá)質(zhì)粒pETNOX-1轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細(xì)胞BL21，涂布于LB培養(yǎng)基平板，挑取單個(gè)菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，按1%比例轉(zhuǎn)接于5 mL 2-YT培養(yǎng)基中，待OD值達(dá)0.6時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7.2 目的蛋白純化 取200 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液在4℃、8000×g離心10 min后棄上清，沉淀用PBS洗滌2次，重懸于10 mL Binding Buffer中，并使用超聲波破碎（45%，工作5 s，間歇5 s）。待破菌懸液至透亮后4℃、8000×g離心10 min，上清用0.45 μm濾膜過濾后，應(yīng)用Ni-NAT His Bind Purification Kit純化目的蛋白（操作方法參照試劑盒說明），純化產(chǎn)物使用SDS-PAGE進(jìn)行分析，最后用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定目的蛋白含量。

1.8 His-NOX-1酶促活性及其影響因素的測(cè)定

1.8.1 His-NOX-1的酶活性測(cè)定 反應(yīng)體系為2 mL，0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.5）含1 mmol/L 的二硫蘇糖醇（DTT），實(shí)驗(yàn)組加入His-NOX-1蛋白至終濃度為5 μg/mL，然后加入黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔基至終濃度為10 μmol/L，在25℃作用5 min后加入底物牛支原體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）至終濃度為500 μmol/L，每隔一定時(shí)間在OD340處讀取數(shù)值。同時(shí)以不加NADH為對(duì)照組，不加His-NOX-1的為空白組，其他反應(yīng)條件不變。His-NOX-1的比活力計(jì)算公式為：

1.8.2 溫度對(duì)His-NOX-1活性的影響 在pH7.5條件下，分別測(cè)定4℃、20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、60℃時(shí)的His-NOX-1酶促活性，每個(gè)溫度重復(fù)測(cè)3次。

1.8.3 pH對(duì)His-NOX-1活性的影響 以25℃為條件，分別測(cè)定pH為2.0、4.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0時(shí)的His-NOX-1酶促活性，每個(gè)pH值重復(fù)測(cè)3次。

1.8.4 底物濃度對(duì)His-NOX-1活性的影響 利用上述方法在確定最適溫度和pH的情況下，分別測(cè)定NADH終濃度為50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L、1 mmol/L時(shí)的His-NOX-1酶促活性，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)3次。

1.9 多克隆抗體的制備及效價(jià)的測(cè)定將純化的His-NOX-1與等體積的弗氏完全佐劑混合并充分乳化后免疫新西蘭兔，首免劑量為800 μg/只，背部皮下多點(diǎn)注射。首免后2周進(jìn)行第2次免疫，劑量減半（400 μg/只）并加等體積的弗氏不完全佐劑，之后每隔1周免疫1次，劑量和方法與2免相同。第4次免疫1周后采血，靜置后吸取血清，并使用間接ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)。

1.10 膜蛋白的提取取200 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的M.bovis臨洮株菌液，8000×g離心10 min后棄掉上清，1×PBS洗滌3次，使用適量PBS懸浮菌體沉淀使之形成原體積150倍濃縮。從中吸取16 μL菌液，加入4 μL的5×上樣Buffer制成全菌上樣蛋白，在剩余的菌液中依次加入50 μL的蛋白酶抑制劑和終濃度為3% TritonTMX-114后，充分混勻并于4℃靜置30 min，37℃水浴10 min。9500×g離心10 min，將上層水相（胞漿蛋白）和下層油相（膜蛋白）分別移入干凈的離心管中（棄去水相和油相交界處的液體），分別加入3倍體積的-20℃預(yù)冷的乙醇，置-20℃凍存3 h以后，4℃、9500×g離心10 min，棄上清，沉淀于超凈臺(tái)中風(fēng)干后，分別加入等體積的1×PBS（含8 mol/L尿素）溶解，用于分析His-NOX-1在M.bovis中的分布。

1.11 His-NOX-1在M.bovis內(nèi)的分布

1.1 1.1 Western blot分析 分別取8 μLM.bovis全菌蛋白、胞漿蛋白、膜蛋白及His-NOX-1蛋白，經(jīng)SDSPAGE分離后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜（NC膜）；將NC膜置5%脫脂乳中于4℃封閉過夜后，除去封閉液，加入適量用TBST稀釋的His-NOX-1抗血清（1∶2000稀釋），37℃孵育2 h后用TBST洗滌3次，每次10 min；加入TBST稀釋的羊抗兔IgG-HRP（1∶1000稀釋），37℃孵育1 h后用TBST洗滌3次，每次10 min，洗滌后用DAB顯色試劑盒顯色。

1.1 1.2 ELISA檢測(cè) 取M.bovis胞漿蛋白和膜蛋白溶液各10 μL，分別加入90 μL包被液中，混勻后移入酶標(biāo)板的不同孔中，37℃靜置1 h后置4℃包被過夜。TBST洗滌3次（每次5 min）后，每孔加入200 μL 5%脫脂乳，37℃孵育3 h。TBST洗滌3次（每次5 min），每孔加入100 μL用TBST稀釋的His-NOX-1抗血清（稀釋比例1∶2000），37℃孵育1 h。TBST洗滌3次（每次5 min）后，每孔加入100 μL TBST稀釋的山羊抗兔IgG-HRP（稀釋比例1∶8000），37℃孵育1 h。TBST洗滌3次后，每孔加入100 μL TMB顯色液，避光顯色10～15 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，并于450 nm處測(cè)定OD值。

2 結(jié)果

2.1 NOX-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定以粗提的M.bovis基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得NOX-1基因的5個(gè)片段及NOX-1基因全長(zhǎng)，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳得到1條約1365 bp的目的條帶（圖1），結(jié)果與理論預(yù)期相符合。

圖1 牛支原體臨洮株NOX-1基因的overlap PCR擴(kuò)增Fig. 1 Overlap PCR amplification of M.bovis Lintao strain NOX-1 gene

2.2 NOX-1基因序列分析M.bovis臨洮株NOX-1基因序列與目前國(guó)內(nèi)外牛支原體流行菌株的NOX-1基因序列比較分析結(jié)果顯示，M.bovis臨洮株的NOX-1基因與國(guó)內(nèi)外牛支原體流行菌株的NOX-1基因同源性很高，其中與M.bovisCQ-W70株、M.bovisHB0801株、M.bovisHubei-1株、M.bovis08M株、M.bovisHB0801-P115株、M.bovisHB0801-P150株、M.bovisNM2012株相似性高達(dá)99.6%，與M.bovisHB0801-P180 株相似性99.5%，與M.bovisPG45株的相似性達(dá)98.5%（圖2）。

圖2 M.bovis NOX-1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree on NOX-1 gene of M.bovis

2.3 原核表達(dá)載體pET-NOX-1的構(gòu)建構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-NOX-1用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物大小與理論預(yù)期目的片段大小一致（圖3）。

圖3 pET-NOX-1的雙酶切鑒定Fig. 3 Double endonucleases digestion identification of pET-NOX-1

2.4 His-NOX-1原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化SDSPAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，原核表達(dá)產(chǎn)物His-NOX-1主要以包涵體的形式表達(dá)，大小約為50 kDa，與預(yù)期大小一致，且重組蛋白可以上清的形式表達(dá)（圖 4）。

2.5 His-NOX-1酶促反應(yīng)活性純化的重組蛋白His-NOX-1酶促活性測(cè)定結(jié)果表明，在pH7.5、25℃的條件下，His-NOX-1酶活性隨時(shí)間的變化如圖5所示，因而可得His-NOX-1的比活力為75.9 IU/mg。

2.6 溫度和pH對(duì)His-NOX-1活性的影響不同溫度和pH條件下His-NOX-1酶活性測(cè)定結(jié)果表明， His-NOX-1的酶促反應(yīng)最適溫度為30℃（圖6A），最適pH為7.5，而在pH7.0～pH8.0時(shí)His-NOX-1活性較強(qiáng)，當(dāng)pH低于4.0或高于9.0時(shí)酶活性呈顯著降低趨勢(shì)，甚至失活（圖6B）。

圖4 His-Nox-1原核表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of His-Nox-1 expression

圖5 His-Nox-1重組蛋白酶活性分析Fig. 5 Analysis of His-NOX-1 activity

2.7 His-NOX-1的米氏常數(shù)及最大反應(yīng)速率在不同底物濃度條件下，通過雙倒數(shù)作圖得到兩者之間的關(guān)系式：y=7.5825x+0.0292（R2=0.9978）（圖7），并且求出His-NOX-1的米氏常數(shù)：Km（NADH）=256.41 μmol/L，最大反應(yīng)速率：Vmax=34.25 μmol/（L·min）。

2.8 血清抗體效價(jià)測(cè)定新西蘭白兔4次免疫后進(jìn)行心臟采血并分離抗血清，通過間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，血清抗體效價(jià)在1∶38 400以上。

圖6 A pH對(duì)His-NOX-1活性的影響Fig. 6A Effect of pH on His-NOX-1 activity

圖6 B 溫度對(duì)His-NOX-1活性的影響Fig. 6B Effect of temperature on His-NOX-1 activity

圖7 雙倒數(shù)曲線圖Fig.7 The double reciprocal curve graph

2.9 His-NOX-1在M.bovis內(nèi)的分布Western blot及ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，制備的M.bovisHis-NOX-1兔抗血清能與M.bovis全菌蛋白、純化的His-NOX-1蛋白、胞漿蛋白及膜蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，在約50 kDa處均有明顯的條帶（圖8），證明M.bovisNOX-1在其細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)均有分布。ELISA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，NOX-1在細(xì)胞漿內(nèi)的分布量大于細(xì)胞膜（圖9）。

圖8 His-NOX-1在M.bovis細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中含量分布的Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of distribution of NOX-1 in the membrane and cytoplasm from M.bovis

圖9 NOX-1在M.bovis細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中分布的ELISA分析Fig.9 ELISA analysis of distribution of NOX-1 in the membrane and cytoplasm from M.bovis

3 討論

在1981年，Reinards等[13]就推測(cè)出NOX-1型NADH氧化酶的反應(yīng)機(jī)理。對(duì)于NOX-1型NADH氧化酶，在電子從NADH傳遞給H2O2或H2O的過程中會(huì)經(jīng)過O2-中間體。NADH先把電子傳遞給FAD或FMN的半醌形式（FMNH）再傳給O2，形成O2-。O2-再與H+反應(yīng)生成H2O2。某些NOX-1型NADH氧化酶含有Fe-S簇，電子通過Fe-S簇傳給O2，形成O2-。如萊氏阿原體（A. laidlawii）中的NOX-1含有FMN結(jié)合域和Fe-S簇，因此通過兩種方式都可以得到電子，形成O2-中間體[14]。

包世俊等[15]通過二維電泳技術(shù)結(jié)合Western blot對(duì)滑液支原體WVU1853株免疫相關(guān)膜蛋白進(jìn)行了初步分析，證實(shí)了滑液支原體NADH氧化酶為其膜表面的一種免疫原性蛋白質(zhì)。Zhao等[16]對(duì)M.bovisNOX-1研究發(fā)現(xiàn)，重組NOX-1對(duì)胎牛肺細(xì)胞具有粘附作用，是一個(gè)潛在的毒力因子，并進(jìn)一步證實(shí)了M.bovisNOX-1的產(chǎn)物為H2O2。本研究通過M.bovisNOX-1基因的克隆、表達(dá)、產(chǎn)物酶活性的測(cè)定及亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步研究有關(guān)NOX-1的生物與功能奠定基礎(chǔ)。

本研究參照GenBank中M.bovisHubei株NOX-1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用DNASTAR對(duì)目的基因進(jìn)行初步序列分析，發(fā)現(xiàn)序列中存在4個(gè)編碼色氨酸的密碼子TGA，而TGA在大腸桿菌中為終止密碼子，可導(dǎo)致該基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)的終止，這在一定程度上增加了擴(kuò)增目的基因的難度。因此，本研究設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物，將序列中的色氨酸密碼子TGA突變?yōu)橥x密碼子TGG，先擴(kuò)增出4個(gè)小的基因片段，最后得到總的目的基因。同時(shí)，減小了表達(dá)載體對(duì)NOX-1基因表達(dá)、酶活測(cè)定的影響。

經(jīng)過對(duì)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的酶活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，從4℃開始，在不同的溫度條件下，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶促反應(yīng)逐漸加快，當(dāng)溫度達(dá)到30℃時(shí)，酶促反應(yīng)速率達(dá)到了最大，之后隨溫度的升高酶促反應(yīng)逐漸降低?？赡苡袃煞矫娴脑颍阂皇堑孜锘蛘咻o基的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，二是溫度過高導(dǎo)致底物發(fā)生了一定程度的降解。His-NOX-1在pH 7.0～8.0之間酶促反應(yīng)較高，在pH為7.5處出現(xiàn)最高峰，判定pH7.5為最適pH，這一結(jié)果與大多數(shù)的NADH氧化酶相一致。

Western blot及間接ELISA檢測(cè)了M.bovis臨洮株His-NOX-1的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，M.bovisHis-NOX-1在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中均有分布，且細(xì)胞膜的分布量小于細(xì)胞漿，這將為M.bovis膜蛋白的研究提供一定的依據(jù)。